Тестирование на антитела к ВИЧ существует с 1985 года.
С того момента технология тестирования пережила значительную эволюцию: появилось много новых и усовершенствованных тест-систем, предназначенных как для исследовательских, так и для клинических целей. Поскольку лечение ВИЧ-инфекции невозможно, если не будет определен ВИЧ-статус, очень важно понимать, какие тесты существуют, и какие у них есть ограничения.
“В 1985 году главной целью тестирования было сканирование запасов донорской крови”, – вспоминает Стив Морин, директор Университета Калифорнии, Сан-Франциско.
На тот момент еще не существовало способов лечения ВИЧ-инфекции. Также никто не знал, всегда ли у человека с ВИЧ развивается СПИД и через какое время это может произойти.
Единственными медицинскими мерами было лечение оппортунистических заболеваний, которые появлялись, когда ослабевала иммунная система. Так что у людей не было мотивации, чтобы узнавать свой ВИЧ-статус.
В то же время, многие люди, которые считали, что у них был риск, хотели узнать, есть ли у них ВИЧ. По словам Морина это привело к
“опасению, что люди, которые хотят узнать о наличии у себя инфекции, начнут сдавать кровь, чтобы им сделали тест”.
Чтобы исключить такую возможность, федеральное и региональные правительства открыли альтернативные кабинеты тестирования, где люди могли бы узнать свой ВИЧ-статус. Опять же основной целью системы здравоохранения при тестировании была “профилактика… чтобы люди не передали вирус кому-либо еще”.
Но с появлением профилактики для предотвращения оппортунистических инфекций, а позднее – антиретровирусной терапии, цели тестирования изменились. Тесты на ВИЧ стали условием для лечения, и заодно, средством профилактики.
ВИЧ-инфекция подтверждается двумя разными тестами – скрининговым тестом и подтверждающим тестом. В своей недавней статье для Университета Калифорнии в Сан-Франциско исследователь из Университета Мариленда Ниел Константин объясняет, что
“скрининговые тесты обладают очень высокой чувствительностью, в то время как подтверждающие тесты обладают высокой специфичностью. Из-за высокой чувствительности скрининговые тесты могут давать ложноположительные результаты”.
Поскольку для скрининговых тестов есть вероятность ложноположительных результатов, обычно при получении первичного положительного результата берется тот же образец крови и скрининговый тест дублируется второй раз, и если он опять положительный, только тогда проводится подтверждающий тест другого типа. Подтверждающие тесты проводятся только для образцов крови, которые неоднократно дают положительные результаты (являются “реактивными”).
Комбинация из двух разных типов тестов гарантирует, что полученные результаты обладают “высокой точностью”. Константин отмечает, что технические ошибки и редкие биологические факторы нельзя полностью исключить.
Обычно для него используют в качестве подтверждающего теста иммунный блотинг. Точно такая же технология (диагностика с помощью ИФА и иммунного блотинга) применяется для выявления огромного числа заболеваний, например, для диагностики болезни Лайма. На самом деле иммунологические методы, на которых основаны эти тесты, настолько фундаментальные, что Салли Лиска, глава городской лаборатории здравоохранения Сан-Франциско, называет их “серология 101”.
ИФА используется как первоначальный скрининговый тест по двум причинам. Во-первых, он обладает очень высокой чувствительностью. Во-вторых, он достаточно дешев и прост для применения. Лиска добавляет:
“Обрабатывать образцы с помощью ИФА намного проще. Требуется небольшой объем крови. Процесс менее трудоемкий. Он гораздо более автоматизирован”.
Только небольшая часть из них одобрена для применения в США, а некоторые из тестов одобрены только для исследовательских целей. Эти тест-системы используют искусственно созданные белки ВИЧ, которые “ловят” специфические антитела, которые организм вырабатывает в ответ на белки вируса. Как только антитела пойманы, объясняет Константин, они “могут быть определены реагентами, которые применяются вместе с индикатором, например, ферментом, который приводит к изменению цвета”. Изменения цвета считываются машиной, которая и определяет результат.
Иммунный блотинг действует по похожей схеме, но для него используется электрическое поле, которое различает различные компоненты на основе их молекулярной массы. Это позволяет определить антитела к специфическим вирусным антигенам, которые затем изображаются на бумаге как различимые “полоски”. Иммунный блотинг, по словам Лиски:
“Несколько сложнее для проведения… и гораздо более трудоемок”. Иммунный блотинг также менее чувствителен, добавляет она, поэтому он “никогда не должен применятся сам по себе”.
Иммунный блотинг – самый распространенный подтверждающий тест, но были разработаны и другие тесты для этой цели, например, анализ на непрямые флуоресцирующие антитела, или радиоиммунный анализ. “При условии правильного проведения и интерпретации, эти очень специфические тесты не дают ложноположительных результатов”, – пишет Константин.
Главный недостаток тестирования на антитела – это “период окна”, то есть период, который требуется организму, чтобы выработать антитела в ответ на инфекцию. Стандартные тесты на ВИЧ не определяют вирус сам по себе, но антитела, которые вырабатывает организм. До того, как в организме выработаются антитела, у человека может быть ВИЧ, и вирус может передаваться другим людям, но при этом тест на антитела к ВИЧ будет отрицательным.
Когда первые тесты на ВИЧ были одобрены, период окна варьировался от 6 до 12 недель, но более современные технологии позволяют определить более низкий уровень антител, и поэтому тесты могут дать положительный результат и раньше.
“Современные тест-системы могут определить ВИЧ-инфекцию через 3-5 недель у большинства людей”, – пишет Константин. – “Это верно, как для всех тест-систем ИФА, так и для экспресс-анализов. Некоторые тесты чаще показывают положительный результат через 3 недели, но в целом они все эквивалентны”. Однако он объясняет, что это “зависит от человека (у которого антитела могут вырабатываться не так быстро, как у других)”.
Ранее все тесты проводились на крови. Недавно были разработаны тест-системы для определения антител в слюне и моче. Оральный тест – OraSure, первый был одобрен для применения в США, следует протоколу скрининга/подтверждения, как и другие тесты на ВИЧ. Это не совсем тест на слюну, для него используется небольшой соскоб жидкости с десен.
Главное преимущества таких тестов – неинвазивная процедура, которая более комфортна для многих пациентов, а также такие тесты можно использовать в местах, где забор крови невозможен по санитарным или практическим соображениям. Тесты на мочу также были разработаны, но они не привлекают такого внимания как тесты на слюну, так как не было одобрено подтверждающего теста на мочу, и для подтверждения результата все равно нужно сдавать кровь.
Другой инновацией стали экспресс-тесты на ВИЧ. При использовании обычных тестов образец крови посылается в лабораторию, и в результате пациент может прождать неделю прежде чем получить результат. Экспресс-тесты делаются на месте, и результат можно получить в течение получаса. Как и в случае с ИФА, положительный результат нуждается в подтверждающем тестировании иммунным блотингом.
Преимущества экспресс-тестов в том, что они исключают ситуацию, когда пациент не возвращается за результатом. В анонимных кабинетах тестирования на ВИЧ уровень не возвращающихся пациентов довольно низок, но в таких учреждениях как клиники по лечению ИППП, около 30% пациентов не приходят, чтобы узнать результат.
Согласно Константину, экспресс-тесты
“показали такую же точность, как и ИФА, при условии, что они выполняются осторожно и квалифицированным персоналом. Возможность совершения технической ошибки для таких тестов, как ни парадоксально, выше, потому что процедура кажется слишком простой, и пользователь может стать небрежным при его проведении”.
Чтобы решить эту проблему многие экспресс-тесты обладают сейчас встроенными системами контроля, которые должны определить, соблюдена ли процедура тестирования.
Вскоре после инфицирования ВИЧ у некоторых пациентов развивается острая (или “первичная”) ВИЧ-инфекция – период заболевания с симптомами, похожими на грипп, например, лихорадкой. Аналогичные симптомы может вызвать грипп и многие другие инфекции. Многие ученые считают, что в этот период человеку нужно назначить лечение, при условии, конечно, что был поставлен верный диагноз. В то же время лечение острой ВИЧ-инфекции остается спорным вопросом.
На данный момент для подтверждения подозрений на острую ВИЧ-инфекцию рекомендуется тестирование на РНК ВИЧ (ПЦР, тест на вирусную нагрузку). Обычный тест на антитела не определит острую ВИЧ-инфекцию, так как она проходит в “период окна”, когда антитела еще не производятся.
Тесты на вирусную нагрузку могут давать ложноположительные результаты. Тем не менее, анализ данных исследований, опубликованный еще в 1999 году в журнале “American Family Physician” говорит, что вполне возможно достаточно точное определение острого периода: “Во время периода острой ВИЧ-инфекции тест на вирусную РНК показывает результат более 50 000 копий/мл. Было зарегистрировано три случая ложноположительных РНК-тестов на ВИЧ-1, но во всех случаях пациенты были бессимптомными, и вирусная нагрузка была у них менее 2 000 копий/мл. Присутствие высокого титра РНК ВИЧ-1 (более 50 000 копий/мл) в отсутствие антител к ВИЧ позволяет диагностировать острую ВИЧ-инфекцию”.
На настоящий момент ни один тест на вирусные частицы не был одобрен для постановки диагноза ВИЧ-инфекция у пациентов. Тем не менее, в США одобрен тест на вирус для скрининга больших объемов донорской крови. Если тест на вирусную нагрузку недоступен, при подозрении на острую ВИЧ-инфекцию рекомендуется тестирование на антиген p24 – вирусный белок. В любом случае, как только закончится срок для “периода окна” диагноз должен быть подтвержден стандартным тестированием на антитела.
В научных целях могут использоваться тест-системы ИФА, чья точность была намерено занижена. Такие тесты используются потому, что уровень антител после инфицирования следует определенной и предсказуемой схеме. Через 4-6 месяцев после передачи ВИЧ этот уровень резко поднимается, а затем достигает постоянного уровня – плато – который остается неизменным на протяжении многих лет.
Современные тест-системы ИФА могут определить очень низкий уровень антител. ИФА с пониженной точностью больше не используются для диагностики среди пациентов. Однако их могут применять ученые и врачи, чтобы понять, произошла ли передачи вируса недавно, или это давняя инфекция. Если инфекция недавняя, то менее чувствительный тест, который становится положительным только к 6 месяцам, сможет это показать.
Константин суммирует свой обзор, говоря, что между различными и эпидемиологическими институтами был достигнут полный консенсус в отношении тестирования на ВИЧ:
“Тесты на антитела обладают чувствительностью практически на 100%, и специфичностью примерно на 99%”.
Такой уровень точности тестирования был показан в большом количестве исследований, включая регулярные оценки достоверности коммерческих тест-систем, поступающих на рынок, которые проводит Всемирная организация здравоохранения.
Эта аннотация была написана Брюсом Миркинемом для Центра по контролю заболеваемости и профилактике США (CDC) в связи с изменениями в официальных руководствах по тестированию в этой стране. В этой статье говорится о надежности тестов и новых системах тестирования, которые не так давно начали регистрироваться в США.
Верификация ВИЧ-инфекции
Для верификации ВИЧ-инфекции у человека используются 3 группы методов: наличие ВИЧ-специфических антител, наличие ВИЧ-антигенов и присутствие геномной РНК ВИЧ. Выявлять указанные предикторы ВИЧ-инфекции можно в крови, слюне и моче. При этом чаще всего используется кровь.
Антитела к ВИЧ определяются двумя различными методами – иммуноферментным анализом и Вестерн-блоттингом.
Самый часто используемый метод из данной группы – иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Исследуемая сыворотка разводится в 400 раз и наносится на плашку с зафиксированными антигенами ВИЧ. При этом если имеются антитела, специфичные по отношению к ВИЧ, они связываются с ними. Далее плашка промывается водой. Для увеличения чувствительности на неё наносятся вторичные антитела (антитела к антителам против антигенов ВИЧ), соединённые с ферментом для качественной реакции (чаще всего используется пероксидаза хрена). Далее на плашку вводится субстрат для фермента. В случае наличия антител против ВИЧ в сыворотке наблюдается качественная реакция. Метод отличается высокой чувствительностью, однако требуется очень чёткое определение того уровня флуоресценции, начиная с которого результат анализа можно считать положительным. Следует отметить, что ИФА даёт информацию о наличии антител, способных реагировать с ВИЧ, при этом о самих антителах ничего не известно – ни их структура, ни их специфичность, ни антигенная ориентированность. В связи с этим при ИФА возможны ложноположительные реакции, как например, при системной красной волчанке. Для более точной диагностики положительные результаты ИФА обычно дополняют постановкой Вестерн-блоттинга.
Перед постановкой качественной реакции Вестерн-блоттинга рекомбинантные белки ВИЧ, с которыми будет ставиться реакция, прогоняют через ПААГ-электрофорез, чтобы разделить белки на фракции. Далее их переносят на мембрану и пропускают через исследуемую сыворотку. Принципиальное отличие от обычного иммуноферментного анализа заключается в выявлении конкретных фракций антител к ВИЧ. Наличие антител к хотя бы одному продукту из каждого из трёх генов ВИЧ (GAG, POL, ENV) можно трактовать как положительный результат реакции. Полное отсутствие фракций антител рассматривают как отрицательный результат. Другие варианты свидетельствуют о неопределённом результате теста. Как правило, неопределённый результат возникает в острую стадию ВИЧ-инфекции, когда сформирована только одна или две фракции антител к ВИЧ; по прошествии острой стадии в крови будут определяться уже все фракции. Однако неопределённый результат может возникнуть и при неспецифическом взаимодействии некоторых антител крови. Поэтому при неопределённых результатах пациенту рекомендуется повторить тест через месяц, чтобы поставить окончательный диагноз. В подавляющем большинстве случаев при повторении теста через месяц результат становится положительным. Также для верификации неопределённого результата Вестерн-блоттинга можно использовать тест на антигены ВИЧ и/или ПЦР геномной РНК.
Из всех антигенов ВИЧ ранее всего в плазме крови можно определить p24 (находящийся в капсиде вируса), и на данный момент это единственный антигенный тест, широко используемый для диагностики ВИЧ. Для его проведения смешивают образец исследуемой крови с моноклональными антителами к p24, а также с вторичными антителами, связанными с ферментом качественной реакции. При наличии p24 в крови происходит окрашивание образца.
В настоящий момент данный тест широко используется в России, но практически не используется в США и Европе [58] из-за своей низкой чувствительности. Помимо этого, он прогностически ценен лишь в определённый период заражения, когда не сформированы фракции антител к ВИЧ. Данный тест успешно заменяется тестом на РНК ВИЧ.
Диагностика ВИЧ-инфекции по геномной РНК производится с помощью полимеразной цепной реакции в сочетании с обратной транскрипцией (RT-PCR). Сначала образец крови центрифугируют для выведения РНК на дно пробирки. После этого в пробирку добавляют реакционную смесь, состоящую из ревертазы, буфера для неё и необходимых субстратов. Если в исследуемой пробе имеется РНК ВИЧ, то по ней амплифицируется ДНК. Далее смесь подвергаются обычной процедуре ПЦР. В конце каждого цикла реакции измеряется степень флуоресцеирования раствора за счёт образовавшихся молекул. По степени флуоресценции определяют количество геномных копий ВИЧ. Далее строится калибровочная кривая, по которой определяется концентрация копий РНК ВИЧ в нулевой момент времени (в начале реакции).