Ионные каналы играют важную роль в самых различных биологических процессах, включая развитие рака человека. Однако общее влияние ионных каналов на опухолегенность при раке молочной железы остается спорным.
Мы проводим метаанализ микрочипов на 280 генах ионного канала. Мы идентифицируем потенциальные ионные каналы, которые участвуют в раке молочной железы на основе профилирования экспрессии генов. Мы проверяем взаимосвязь между экспрессией генов ионного канала и статусом мутации p53, статусом ER и уровнем гистологической опухоли в когорте обнаружения. Молекулярная сигнатура, состоящая из генов ионного канала (IC30), идентифицируется ранним корреляционным тестом Спирмена, проведенным между степенью опухоли и экспрессией генов. Система оценки риска разработана на основе IC30. Мы тестируем прогностическую силу IC30 в открытии и семь когорт для проверки как по пропорциональной регрессии пропорциональности, так и по логарифмическому рангу.
Было обнаружено, что гены ионного канала 22, 24 и 30 дифференциально экспрессируются с изменением статуса мутации p53, статуса ER и гистологического уровня опухоли в когорте обнаружения. Мы назначаем 30 генов ионного канала, связанных с опухолью, в качестве сигнатуры гена IC30. Мы обнаружили, что оценка риска IC30 предсказывает клинический результат (P 0), а 17 генов были отрегулированы (log2-преобразованное сменное изменение 0), тогда как 8 генов были отрегулированы (log2-преобразованное изменение смены 0 означает, что ген повышается у пациентов с более высоким уровнем, тогда как отрицательный коэффициент корреляции указывает на снижение регуляции у пациентов с более высоким классом. Белые клетки в тепловой карте означают, что данные экспрессии генов недоступны в соответствующих наборах данных. Вертикальная пунктирная линия разделяет кластеры генов с уменьшением и повышением частоты (AU = 1 для обоих кластеров).
Мы сравнивали экспрессию гена ионного канала между ER положительными и отрицательными пациентами в когорте SIN. В общей сложности 213 пациентов были идентифицированы как ER-положительные, а 34 пациента были идентифицированы как ER-отрицательные. Двадцать четыре гена ионного канала были идентифицированы как дифференциально выраженные между двумя группами; 16 генов были усилены у пациентов с положительной реакцией ER, в то время как 8 генов были подавлены (Таблица 3 и Рисунок 4). Среди этих дифференциально экспрессированных генов все каналы Ca2 + (за исключением CACNA1A) и Na + -канала были усилены в ER-положительной группе, тогда как структура экспрессии K + -канала и Cl-каналов была более гетерогенной. Девятнадцать из 24 дифференциально экспрессированных генов перекрываются с генами, дифференциально выраженными между мутантами р53 и опухолями дикого типа (рис. 1 и 4), который статистически значим (Р 1,25 считались дифференциально выраженными. Те же методы и критерии были применены для идентификации генов, дифференцированных по выражению между положительными и отрицательными пациентами в группах SIN, FRA, USA1 и USA2.
Установление ассоциации экспрессии генов семейства GST и клинико-морфологических характеристик у пациенток с отечно-инфильтративным и первично-диссеминированным раком молочной железы
Следует отметить, что в представленных исследованиях при изучении роли глутатион-S-трансферазы (GST) в разивитии химиорезистентности при раке молочной железы (РМЖ) проводилось определение полиморфизма генов GST у пациенток с раком молочной железы, а также иммуногистохимическое определение экспрессии изоферментов GST, однако не проводилось определения экспрессии генов суперсемейства GST.
В качестве материала для исследования использованы парафинфиксированные срезы образцов опухолевой ткани пациенток.
Таблица 8. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с ОИФ РМЖ (сТ4N0-3М0)
Таблица 9. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с раком молочной железы с наличием отдаленных метастазов (сТлюбаяТлюбаяМ1, IV стадия)
Расчет процента уровня нормализованной экспрессии генов семейства GST проводился по формуле:
2 — (Ct интересующего гена образца — Ct гена HGUS образца) х 100%,
где Ct — пороговый цикл (cycle threshold).
В связи высоким процентом отсутствия экспрессии гена GSTM1 (63,3%) у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ при статистической обработке данный ген рассматривался как номинальный.
При анализе взаимосвязи экспрессии генов семейства GST с гормон-рецепторным статусом опухоли у пациенток с ПД РМЖ (табл. 10) определены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от эстроген- (p = 0,002) и прогестерон-рецепторного статуса (p = 0,001): так в эстроген- и прогестерон-негативных опухолях отмечена более высокая экспрессия данного гена, чем в эстроген- и прогестерон-позитивных новообразованиях (рис. 21), что согласуется с данными W. H. Peters (1993), L. Gilbert (1993), R. Silvestrini (1997).
Таблица 10. Экспрессия генов GST в зависимости от гормон-рецепторного статуса опухоли у пациенток с IV стадией РМЖ
Рис. 21. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от рецепторного статуса опухоли у пациенток с раке молочной железы IV стадии
Следует отметить, что определение экспрессии GSTP1 в данных исследованиях проводилось иммуногистохимическим методом. При этом у пациенток с ОИФ РМЖ данная ассоциация экспрессии гена GSTP1 с гормон-рецепторным статусом опухоли отсутствовала. Для генов GSTM1 и GSTT1 статистически значимых различий в экспрессии у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было.
При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов GST с экспрессией белка Her2neu в опухоли у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различий в экспрессии в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было. При этом в исследованиях A. Romero и S. Lizard-Nacol также не найдено ассоциации между экспрессией GSTT1, GSTM1 и характеристиками опухолевого процесса, а в исследованиях C. Bellamy, R. L. Franco и J. Huang не выявлено ассоциации экспрессии GSTP1 и онкобелка Her2-neu.
Выявлены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли (рис. 22) у пациенток с ПД РМЖ (p = 0,005).
Рис. 22. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли у пациенток с ПД РМЖ
Так люминальный подтип опухоли характеризуется низкой нормализованной экспрессией гена GSTP1 (73,22% (9,31-1611,13%)), в то время как при базальноподобном подтипе опухоли наблюдается высокая экспрессия гена GSTP1 (284,87% (15,5-912,61%)). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов выявлено не было (p > 0,05).
Полученные данные согласуются с результатами исследования T. Miyake et al., согласно которым люминальный А-, люминальный B- и HER2-позитивные злокачественные новообразования были значительно реже 08ТР1-позитивны (по данным иммуногистохимического метода исследования), чем базальный тип опухолей (р = 0,002, p 0,05). Для других генов семейств GST у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различии в нормализованной экспрессии генов в зависимости от гистологических параметров опухоли выявлено не было (p > 0,05).
Определены статистически значимые различия в экспрессии гена GSTT1 у пациенток с ОИФ РМЖ в зависимости от вовлеченности в опухолевый процесс регионарного лимфатического аппарата (p = 0,037) (табл. 11): при более распространенном опухолевом поражении cN3 отмечена более низкая экспрессия гена GSTT1 (12,76% (0-75,79%)), при этом данная зависимость у пациенток с ПД РМЖ отсутствовала (p > 0,05). В проведенных ранее исследованиях не выявлено взаимосвязи между экспрессией гена GSTT1 и поражением лимфатического коллектора.
Таблица 11. Экспрессия генов семейства GST в зависимости от степени поражения лимфатического аппарата (cN) у пациенток с ОИФ РМЖ
При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов семейства GST с размерами первичного очага (табл. 12) статистически значимые различия в нормализованной экспрессии выявлены для гена GSTP1 (p = 0,041) у пациенток с ПД РМЖ.
Таблица 12. Экспрессия генов GSTв зависимости от размеров первичного очага и поражения регионарных лимфатических узлов у пациенток с раком молочной железы IV стадии
При распространении первичной опухоли на грудную стенку и/или кожу (Т4) отмечена более высокая экспрессия гена GSTP1 (202,1% (9,31-1611,13%)) (рис. 23). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов в зависимости от размеров первичного очага выявлено не было (p > 0,05).
Рис. 23. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от размеров первичного очага у пациенток с раком молочной железы IV стадии
Полученные данные о более высокой экспрессии гена GSTP1 у пациенток с ПД РМЖ при сТ4 (p = 0,041) находятся в соответствии с результатами исследования B. V. Jardim, в котором продемонстрировано, что высокий уровень экспрессии 08ТР1 (по данным иммуногистохимического метода исследования) был ассоциирован с III стадией и большим размером новообразования (р 0,05) (табл. 13).
Таблица 13. Ассоциация экспрессии генов семейства GST с общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования у пациенток с ОИФ РМЖ
При унивариантном анализе влияния экспрессии генов семейства GST на общую выживаемость у пациенток с ПД РМЖ, получавших как часть специального лечения полихимиотерапии (ПХТ) с включением антрациклинов (табл. 14), статистически значимых различий выявлено не было (p
План лечения составляют с учётом стадии опухолевого процесса, морфологической структуры опухоли, возраста больной, сопутствующих заболеваний, общего состояния пациентки. Применяют следующие методы лечения: хирургический, комбинированный (сочетание операции с лучевой или лекарственной терапией) и ком.
По данным многочисленных публикаций, этиология и патогенез РМЖ сложны и определяются сочетанием многих факторов. Гормональная регуляция функции молочных желез значительно сложнее, чем эндометрия. Помимо эстрогенов и прогесторона, развитие молочных желез в пубертатном периоде, их функция во время бер.
Гистологическую градацию рака молочной железы впервые ввел R.B. Greenough из Бостона, который в 1925 г. опубликовал анализ 73 случаев рака молочной железы. Несмотря на то что прошло много времени и опубликовано большое количество работ о применении гистологической градации рака молочной железы, ниче.
При анализе данных, получаемых с помощью ультразвукового исследования, целесообразно выделить ряд диагностических задач, решение которых позволит получить полный комплекс эхографических признаков рака молочной железы и метастатических лимфатических узлов, по которым в дальнейшем будет производиться .
Рак молочной железы развивается из эпителия млечных протоков и альвеол. Патоморофологическая характеристика рака молочной железы включает такие параметры, как размер первичного очага, его локализацию в молочной железе, тип роста, морфологическое строение, степень дифференцировки, наличие регионарных.
Патологические процессы в молочной железе отличаются многообразными клиническими проявлениями, что норой создает серьезные дифференциально-диагностические трудности. Для гипеколога важнее всего заметить (не пропустить!) патологию молочных желез, что приведет в движение систему методов уточня.
Доброкачественные изменения молочных желез относятся к наиболее распространенным заболеваниям и включают различные по клиническим, морфологическим и этиологическим признакам процессы. Отличительной особенностью молочной железы является сложность четкой дифференцировки физиологических и патологически.
д-р биол. наук, заведующая ген тест лабораторией, институт биоорганической химии Академии наук
канд. мед. наук, доц. кафедры акушерства гинекологии и Перинатальной медицины Ташкентского института усовершенствования врачей
INFLUENCE OF EXPRESSION OF MDR1 GENE OF EFFICIENCY OF TREATMENT OF A BREAST CANCER
Diloram Kadyrova
doctor of biological sciences, head of the gene test laboratory, institute of bioorganic chemistry of the Academy of Sciences
Landish Isanbaeva
docent. Doctor of Philosophy. Ph.D. Tashkent Institute of Postgraduate Medical Education. Department of Obstetrics Gynecology and Perinatal Medicine,
АННОТАЦИЯ
Рак молочной железы (РМЖ) – это наиболее часто встречающийся вид рака со смертельным исходом среди женщин в мире. При выполнении данной работы авторами проведено изучение функциональной активности Р-гликопротеина у больных при раке молочной железы до лечения и после неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). На основании полученных
результатов было показано, что 5 больных обладают первичной лекарственной устойчивостью. Было отмечено увеличение уровня экспрессии гена MDR1 после НАХТ у больных с первичной лекарственной устойчивостью, по сравнению с уровнем до лечения. Авторы пришли к выводу, что при высокой функциональной активности Р-гликопротеина больные резистентны к лечению, т.е. плохо отвечают на действие лекарственных препаратов.
ABSTRACT
A breast cancer (BC) is a most often meeting type of cancer with deathamong women in the world. At performing this workauthors have carried out studying of functional activity of the P-glycoproteinat patients at a breast cancer before treatment and after neoadjuvant chemotherapy (NACHT) .On the basis of the received results it has been shownthat 5 patients possess primary medicinal stability.The increaseexpression level of MDR1gene was marked after NACHT at patients with primary medicinal stability, in comparison with level before treatment.Authors have come to a conclusion that at high functional activity of the P-glycoproteinpatientsresistant to treatment, i.e. badly answer effect of medicines.
Ключевые слова: рак молочной железы; Р гликопротеин; ген MDRI;лекарственная устойчивость; пациенты резистентные к лечению.
Keywords: аbreast cancer; P-glycoprotein;MDR1gene; primary medicinal stability; patientsresistant to treatment.
Рак молочной железы – одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от РМЖ, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов. Лечение данной категории больных остается одной из наиболее сложных задач современной онкологии. На сегодняшний день множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам является одной из наиболее важных причин неэффективности терапииРМЖ. Развитие МЛУ, связывают и с плохим ответом на химиотерапию и с плохим прогнозом.Резистентность опухолевых клеток к химиотерапии может быть следствием разнообразных процессов: от снижения внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, обусловленного активным выведением вещества в межклеточную среду АТФ-зависимым трансмембранным белком Р-гликопротеином, являющимся продуктом гена АВСВ1 или MDR1[5,c.605; 4, с.63], до нарушения механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках (мутация или снижение экспрессии гена р53, нарушающие его проапоптотическую функцию)[2,c.427].
Цель исследования: Определение роли транспортного белка Р-гликопротеина, продукта экспрессии генаMDR1 в формировании множественной лекарственной устойчивости при лечении злокачественных новообразований молочной железы.
Методы исследования:
Выделение ядерной ДНК из лейкоцитов крови. Все процедуры проводили в стерильных условиях. К 0,5мл периферической крови добавляли 2мл стерильной Н2О, пробы инкубировали при комнатной температуре 2 часа. Клетки лейкоцитов осаждали при 3000 об/мин, 4 0 С, в течение 15 мин. Надосадочную жидкость аккуратно удаляли, к осадку желто-красных лейкоцитов добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды и хранили при –20° С.К суспензии лейкоцитов (1х10 6 ) добавляли 1мл лизирующего буфера (100мМ Tris-HCl, рН 7,6; 25мМ ЭДТА рН 8,0; 0,15М NaCl; 1% SDS, 2мМ β-меркаптоэтанол), лизис проводили надо льдом 3 мин. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин., 4 0 С, 15мин. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), инкубация 15-20 мин при покачивании. Пробы центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин, 4 0 С. К супернатанту добавляли хлороформ (1:2), инкубация при покачивании в течение 15-20 мин при 160 об/мин, пробы центрифугированием при 5000 об./мин, 4 0 С, 10 мин. Супернатант осаждали в 3 кратном объеме 96% этанола в присутствии 3М раствора ацетата натрия рН 5,2, пробы оставляли на ночь при –20 0 С. Препараты ДНК промывали раствором 70%-го этанола. Полученные препараты ДНК можно хранить при –20 0 С, в течение месяца. Препараты ДНК/РНК и интактной ДНК анализировали, в 2%-м агарозном геле, содержащем 0,5мкг/мл этидиум бромида. Электрофорез вели 1ч при 100В, гель фотографировали в проходящих лучах УФ.
Обратная транскрипция (ОТ-ПЦР)
Таблица 1.
Последовательность праймеров, использованных в исследованиях