Во множестве публикаций, посвященных раку предстательной железы, заметное место отводится исследованиям на уровне генного аппарата. Результаты публикаций последних лет проливают свет на многие аспекты регуляции клеточного роста и ее зависимости от генной экспрессии, а также на выяснение молекулярных механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую. В резолюции 2-го съезда онкологов стран СНГ (Киев, 2000) подчеркивалась настоятельная необходимость идентификации генов и их продуктов, которые могут служить маркерами опухолевого роста и молекулярными мишенями при разработке высокоспецифических лечебных средств нового поколения.
Предстательная железа, как в возрастном аспекте, так и в условиях развивающихся предопухолевых и злокачественных процессов представляет идеальную модель для изучения молекулярно-генетических профилей. Молекулярная онкология играет все возрастающую роль, и уже сделаны открытия, касающиеся главных механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования рака простаты. Понимание этих механизмов дало возможность выявить факторы, определяющие вероятность метастазирования опухоли. К ним относится и потеря функции E-cadherin, что может помочь клиницистам выбрать наиболее оптимальную, индивидуально обоснованную стратегию лечения.
Процессы локальной инвазии и метастазирования могут возникать в результате нарушения нормальной клеточно-клеточной и клеточно-материнской адгезии, которая обусловлена молекулами клеточной адгезии. Среди них идентифицирован Е-cadherin, выполняющий роль супрессора опухолевой инвазии и метастазирования. E-cadherin является ключевым медиатором клеточно-клеточной адгезии, которая осуществляется путем его взаимодействия с группой субмембранных белков при участии катенинов (а, В и у-катенины), которые служат для закрепления E-cadherin на микроволокнах клеточного скелета.
Уровень содержания E-cadherin соответствует инвазивным и метастатическим свойствам опухолей. Уменьшение уровня E-cadherin может приводить к уменьшению клеточной адгезивности и, соответственно, потенциальной инвазивности раковых клеток. По-видимому, молекулы клеточной адгезии действуют как ключевые ингибиторы клеточной подвижности, тканевой целостности и поддержания дифференциации. Следовательно, потеря экспрессии E-cadherin ассоциируется с плохим клиническим прогнозом и является лимитирующим уровнем в прогрессировании этой болезни.
H.H.Schlechte et al. (2000) подтверждают, что одним из ключевых медиаторов, действующих как опухолевый супрессор в отношении прогрессии рака простаты, является E-cadherin (катениновый комплекс), поскольку те клеточные линии, которые обладают полным набором компонентов этого комплекса, имеют низкий инвазивный потенциал.
В начальной стадии развития рака предстательной железы генетические исследования позволяют определить те вещества, которые направленно действуют на активирование запрограммированной смерти клеток, ингибицию сигнальной трансдукции (передача активирующего сигнала от клетки к клетке), устранение теломеразной активности, а также, как указывалось ранее, использование дифференцированной терапии. Следовательно, одной из наиболее актуальных клинических проблем урологической онкологии является точное определение биологической агрессивности индивидуального злокачественного процесса. Наиболее перспективны исследования по определению различий в экспрессии генов между раковыми клетками и нормальными эпителиальными клетками простаты.
Рис. 20. Мутация опухольсупрессорного гена р53 ведет к утрате контролирующего механизма и поддерживает ненормальный клеточный рост
Нормальная функция белка р53 включает регулирование критических клеточных реакций, вовлекающих G1 и G2-стадии клеточного цикла в реакции поражения ДНК и апоптоза, вызванного некоторыми стимулами типа ДНК-разрушающих средств и гипоксии (L. Н. Hartwell, М. D. Kastan, 1994; Н. Hermeking, С. Lengauer, К. Polvak et al., 1997).
Рис. 21. Справа — выраженная экспрессия гена р53 при раке простаты (иммуногистохимия)
V.Srikantan и S.Srivastava (2003) предлагают гипотетическую модель генеза рака предстательной железы. В основу закладываются молекулярные профили, которые ведут к нарушению дифференциации простатических клеток, прогрессии и началу метастазирования. Модель представляется как интерпретация генетических событий, которые включены в генез комплексного фенотипа новообразований простаты (схема 1).
Схема 1. Гипотетическая модель развития рака простаты
Независимо от точного выбора времени мутаций р53 можно предположить, что мутация связана с прогрессией болезни. Большее количество расстройств р53 замечено в нелеченых метастатических опухолях, чем в нелеченом первичном раке простаты.
Инвазивный, вышедший за пределы органа рак простаты, представлен генетическими событиями, которые наблюдаются при ПИН высокой градации. Весьма вероятно, что они являются предшественниками или дозлокачественными изменениями (клетками) в простате, которые еще не обнаружены, они новые или уникальные, специфические для рака альтерации (рис.22).
Рис. 22. Молекулярные и клеточные изменения в процессе развития рака предстательной железы (по Rinker-Schaeffer et al., 1994, с изменениями)
Альтерации р53, bcl-2-генов обнаруживаются как при локальном раке простаты, и более часто — при прогрессирующих формах. Напрашивается логический вывод: идентификация генов должна проводиться на участке хромосомы, наиболее часто повреждаемой при раке. Опухолевые супрессорные гены создают уязвимые места для критического повреждения ДНК. Центральную роль в контроле клеточной пролиферации, дифференцировании и апоптозе играет протоонкоген с myc, локализованный на хромосоме 8q24.
K.Sato et al. (1999) описывают при локально-прогрессирующем раке простаты (pT3N0M0) определенную корреляцию между myc-амплификацией и частотой рецидивирования, а также послеоперационной выживаемостью после радикальной простатэктомии. Низкий уровень выживаемости обнаруживается при одновременной потере короткого плеча хромосомы 8 в области 8р22.
Молекулярные маркеры
На протяжении более четверти века активно ведутся поиски механизмов осуществления составляющего основу живого организма клеточного цикла, который одинаков для простейших растений, животных и человека. Важнейшей стороной этих фундаментальных исследований может быть открытие естественного, генетически детерминированного процесса нормального клеточного цикла, знания которого пролагают пути к пониманию процессов клеточного деления и раковых образований.
Выяснение нескольких принципиальных вопросов составляет приоритет молекулярно-биологических исследований — возмещается ли отмирающий клеточный материал или же он должен вновь воссоздаваться в процессе роста и клеточного деления, участвуя в механизмах последнего? Что детерминирует внешний сигнал к началу клеточного деления?
P.M.Nurse идентифицировал первую циклинзависимую киназу у человека. Она принадлежит к группе активных молекул, разделяющих S-фазу и за счет восстановленного фосфорилирования оказывает в дальнейшем влияние на протеины.
Фосфатнагруженные протеины удваивают число хромосом и благодаря соответствующим химическим модификациям могут регулировать синтез ДНК. Он установил, что эти эссенциальные функции циклинзависимой киназы возможны в условиях эволюционного процесса.
R.T.Hunt выяснил, что если клетка получает сигнал к репродукции и переходит в фазу G1, то в клеточном ядре обнаруживаются циклиновые белки. Во время роста клетки циклином активизируется циклинзависимая киназа. Начинается удвоение хромосомы. К этому моменту циклин снова перестраивается для того, чтобы избежать увеличения наследственной массы в образцах удвоения. Это является важнейшим механизмом заключительного клеточного цикла. Описываемые закономерности клеточного цикла отражены на рис. 23.
Рис. 23. Клеточный цикл
Среди новых маркеров рака предстательной железы заметное место занимает инсулинподобный фактор роста (ИФР-1), который является митогеном для эпителиальных клеток, стимулирующих прогрессию клеточного цикла от G1 до S-стадии.
Каково же значение последних достижений в генетической и молекулярной биологии для распознавания и терапии злокачественных новообразований, в том числе и рака предстательной железы? Упомянутые ранее исследования лауреатов Нобелевской премии 2001 г. являются определяющими для понимания хромосомальных отклонений (аберраций) во вновь генерированных клетках. При недостаточности адекватно функционирующего контроля в клеточном цикле возникает отчетливый беспорядок прежде всего в делении или потере хромосом.
Гены, кодирующие молекулы циклинзависимой киназы или циклин, могут трансформироваться в онкогены или соединяться с опухольсупрессорными генами. Потеря контроля над клеточным циклом ведет к возможному избыточному росту клеток. В опухолях у человека, включающих рак предстательной железы, обнаруживаются большие количества молекул циклинзависимой киназы и циклина. В этом плане перспективным представляется разработка ингибиторов молекул циклинзависимой киназы. Медикаменты должны вмешаться в сошедший с правильного пути клеточный цикл в опухолевых клетках.
В клеточном цикле активно участвуют теломеры — повторные последовательности ДНК в конце хромосом. После каждого цикла теломеры сокращаются, и по достижении критической длины клетка прекращает разделяться. В процесс включается фермент теломераза, которая может воссоздавать теломеры хромосом после разделения клетки и, таким образом, восстанавливать ущерб, который наносится нормальным взрослым соматическим клеткам в течение последовательных митотических циклов.
Вследствие высокой частоты и одновременно медленного роста рак простаты занимает особое место среди всех злокачественных опухолей. Необычность рака простаты как опухоли состоит еще и в том, что его диагностическое и терапевтическое окна очень узкие. Так, с одной стороны, имеющаяся небольшая ограниченная опухоль в предстательной железе клинически ничем себя не проявляет и, следовательно, не оказывает никакого влияния на содержательность и активность жизненной позиции мужчины.
С другой стороны, рак предстательной железы довольно часто диагностируется поздно, когда выбор адекватного вида лечения оказывается затруднительным либо вовсе невозможным. В этой связи следует отметить, что решающим фактором выживаемости пациентов является биологический потенциал опухоли к началу метастазирования. Именно этим обстоятельством можно объяснить интенсивные разработки раннего распознавания с соблюдением принципов достоверности и объективности.
Раковая прогрессия — это комплексный многоступенчатый процесс, который начинается с трансформации нормальных клеток и продолжается с ростом, инвазией и метастазированием опухоли (рис.24). Хотя точные пути, которые собственно приводят к возникновению рака предстательной железы еще остаются не выясненными, революция последнего десятилетия в молекулярной генетике внесла определенную ясность в клеточные основы данного процесса.
Другой кандидатный ген локализуется на Х-хромосоме. Совсем иной ген, чувствительный к раку простаты, был открыт при широком геномном поиске. Механизмы онкогенеза включают активацию онкогенов таких, как cErb-B, классического онкогена, который при активации кодирует мутированную версию рецептора эпидермального фактора роста (EGF). Этот стволовой рецептор теряет экстрацеллюлярный компонент, который в норме связывает EGF. Таким образом, вместо соответствующего ответа на сигнальную молекулу, мутировавший рецептор стимулирует продолжающееся клеточное деление и не контролирует рост по тирозинкиназному сигнальному пути.
Рис. 24. Комплексный многоступенчатый процесс трансформации нормальных клеток предстательной железы в раковые
Наиболее известным и изученным, влияющим на гормональную зависимость рака простаты, является опухолевый ген-супрессор р53, который локализован на хромосоме 17 (17ql3), продукт его считается основным из регуляторов клеточного цикла. Ген достаточно полно охарактеризован благодаря получению его пространственного изображения (рис. 25).
Основной функцией Р53 как супрессора опухоли является то, что он опосредует клеточную реакцию на повреждение ДНК, чем поддерживается стабильность генома. Нормальная функция этого белка состоит в сохранении клетки в фазе покоя, она либо способна перейти в фазу митоза (деления), либо подвергнуться апоптозу. Наличие дефекта гена р53 фактически характерно для всех опухолей человека, независимо от их типа и локализации.
Рис. 25. Опухолевый супрессорный ген р53
Ген р53, подавляющий опухоль, и протоонкоген bcl-2 стоят в ряду самых важных регуляторов роста клеток и апоптоза. Мутации в аллели р53 приводят к продленному полураспаду существования протеина, который затем выявляется при иммуногистохимическом подсчете. В отличие от других злокачественных опухолей, выделение р53 при локальном раке простаты — довольно редкое явление, но соотносится с прогрессированием опухоли, рецидивом и общим прогнозом. То же верно и для bcl-2, выделение которого происходит в 2,3%—26,9% первичных форм рака простаты (L. Bubendorf et al., 1996).
При детальном рассмотрении оказывается, что р53 — это TSG (tumor suppresse gen — опухолевый супрессорный ген), который участвует в регулировании клеточного цикла на стадии G/S (W.N.Linehan, 1992), а также регуляции апоптоза и действует как ингибитор репликации SV40 ДНК путем отделения антигенов Т-клеток (Т. Boulikas, 1997).
Протеин р53 подавляет связывание полимеразы ДНК на фоне повреждения ДНК на стадии контрольной точки G, клеточного цикла, останавливая таким образом репликацию клеток при наличии нестабильности хромосом. Мутация р53 приводит к непрерывной пролиферации клеток, несмотря на повреждение ДНК. результатом чего является распространение клеток с онкогеииым потенциалом. Ненормальное выделение р53 отмечается в 60% клеточных линий рака простаты с агрессивным течением (L. L.Nielson, D.S. Maneval, 1998). Доказано, что мутации р53 представляют собой независимые предвестники рецидива рака простаты после радикальной простатэктомии.
Еще один ген, р21, играет сходную с р53 роль, подавляя репликацию ДНК при сильном повреждении. Он кодирует протеин, что действует как ингибитор циклинзависимой киназы, индукция которой может также играть роль в репликации и восстановлении ДНК. Таким образом, недостаток функционального гена р21 приводит к сохранению клеточного цикла при наличии поврежденной ДНК.
Несколько иные функции выполняет ген bcl-2.
Несомненно, существуют и другие подобные гены. Кроме онкогенов и опухолевых супрессорных генов, канцерогенез также включает потерю клеточно-клеточной адгезии, которая в норме поддерживает тканевую структуру и препятствует миграции клеток. В частности, делении E-cadherin или b-катенина приводит к повышению клеточной подвижности, предрасполагая к формированию метастазов.
Рис. 26. Иммуноокрашивание гена bcl-2: а — нормальная ткань, б — рак предстательной железы. Ген bcl-2 окрашен в коричневатый цвет
Рядом исследований последних лет идентифицированы гены, имеющие экспрессию в клетках только раковой опухоли предстательной железы и отсутствующие в неизмененных клетках эпителия. К этим генам относится ДДЗ/РСА 3. Дифференцированный фенотипический анализ показал наличие мРНК в злокачественной, а не в доброкачественной ткани простаты. Обнаруживается, что экспрессия ДДЗ является специфической для простаты и значительно выражена при ее раковом поражении. Можно с уверенностью утверждать, что клинические исследования определят, имеют ли эти либо другие молекулы диагностический, прогностический и терапевтический потенциалы.
Несколькими годами ранее предполагалось, что наиболее важной защитой против опухоли является собственная система иммунологического наблюдения. Рак, зародившись в эпителиальных клетках предстательной железы, обычно сначала развивается как узелок и сохраняет в себе последующую способность распространяться в региональные лимфоузлы или отдаленные органы, такие, как кости или легкие. При достижении опухолью размеров более 5 мм она начинает индуцировать развитие собственного кровоснабжения — ангиогенеза. Очевидно, что ангиогенез — это критическое событие в генезе как первичной, так и метастатической опухоли.