Внутриопухолевая гетерогенность рака молочной железы

Предметы

Рак молочной железы
Эпигенетика рака
Метилирование ДНК
Опухолевая неоднородность

Аннотация

Внутриопухолевая неоднородность может привести к смещению выборки и может создать серьезные проблемы для разработки персонализированной медицины и биомаркеров. Несмотря на многочисленные исследования, изучающие генетическую гетерогенность, эпигенетическая внутриопухолевая гетерогенность промоторного гиперметилирования редко диагностируется при раке молочной железы. Чтобы исследовать клональную внутриопухолевую гетерогенность промоторного гиперметилирования, мы выполнили специфичную для метилирования мультиплексную зависимую от лигирования амплификацию зонда (MS-MLPA) для 24 установленных генов опухолевых супрессоров на множественных пространственно разделенных образцах, полученных из 21 первичного рака молочной железы. Был проведен многообластной анализ, представляющий по меньшей мере два и максимум пять блоков опухоли на пациента и четыре области на блок опухоли. Результаты метилирования были гетерогенными в одном или нескольких генетических локусах между различными областями опухоли в 95% карцином молочной железы. Наиболее гетерогенными локусами по убыванию частоты были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%), Неоднородность приводит к изменению статуса метилирования по крайней мере в одном локусе в 65% опухолей. Для большинства генов относительный вклад вариабельности между пациентами и между блоками в общее изменение результатов метилирования был одинаковым. Независимо от гена, вклад изменчивости в пределах блока был незначительным. В заключение, хотя большинство вариаций в статусе метилирования присутствует между отдельными видами рака молочной железы, клональная эпигенетическая гетерогенность наблюдается в большинстве первичных карцином молочной железы, что указывает на то, что метилирование в результате одного случайного образца не может быть репрезентативным для всей опухоли.

Главный

Вариация в пределах одной опухоли, обычно обозначаемая внутриопухолевой гетерогенностью, является теперь широко признанным явлением, характеризующимся секторами (клональная гетерогенность) и даже отдельными клетками (клеточная гетерогенность) различной морфологии, поведения и генетического и эпигенетического состава. В результате сочетания дифференцировки раковых стволовых клеток и клональной селекции под влиянием микроокружения опухоли 1, 2 внутриопухолевая гетерогенность является ключевой переменной для понимания естественной истории опухоли. Это может, однако, привести к смещению выборки и может создать серьезные проблемы для персонализированной медицины, прогнозирования течения заболевания и развития биомаркеров.

Молекулярные данные свидетельствуют о том, что внутриопухолевая гетерогенность может способствовать росту опухоли через разветвленную, а не линейную модель эволюции. 3 Эволюция разветвленной опухоли подчеркивает важность обнаружения повсеместных изменений, присутствующих во всех областях опухоли 4, которые могут привести к превосходным биомаркерам и более эффективной таргетной терапии.

В течение последнего десятилетия было предпринято много попыток выделить и сравнить (эпи) генетически различные субпопуляции с помощью региональной макро- или микродиссекции перед анализом и / или с использованием методов секвенирования следующего поколения. 5, 6 В зависимости от подхода к исследованию (сфокусированный по сравнению с геномом), выборки и разрешающей способности метода анализа, некоторые исследования выявили частую 7, 8, 9, 10 или небольшую 11, 12, 13 внутриопухолевую гетерогенность. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению генетической гетерогенности, эпигенетическая внутриопухолевая гетерогенность промоторного гиперметилирования изучалась лишь в редких случаях. 8, 13, 14, 15, 16, 17

Аберрантное промоторное гиперметилирование и связанное с ним молчание генов-супрессоров опухоли происходит на ранних стадиях развития опухоли и может обеспечить избирательное преимущество для опухолевых клеток. Эти эпигенетические изменения потенциально наследуемы при делении клеток и стабильны во времени, но они также могут быть пластичными и специфичными для аллелей. Тем не менее, недавно было показано, что метилирование ДНК поддерживалось во всех метастазах предстательной железы у одного и того же человека, что указывает на то, что эти эпигенетические изменения могут стабильно поддерживаться в качестве изменений генома водителя, способствующих инициации и прогрессированию рака. 13 Аберрантное метилирование ДНК наблюдается при всех типах и стадиях рака, включая рак молочной железы 18, 19, 20, и измерение статуса метилирования конкретных генов в опухолевой ткани или крови может помочь в раннем выявлении рака, определении прогноза и прогнозировании терапии. ответы. Доступен широкий спектр методов для определения уровней метилирования опухоли, 22 некоторые из них с очень высоким разрешением (например, количественная мультиплексная ПЦР-метилирование), но часто требуют конверсии бисульфита и сфокусированного подхода, а другие с более низким разрешением (например, MSP и специфическое для метилирования мультиплексное лигирование, зависящее от амплификации зонда или MS-MLPA). Последний метод не требует превращения бисульфита, но вместо этого основан на рестриктазе и позволяет применять многоцелевой подход для всего лишь 50 нг ДНК, выделенной из фиксированного формалином материала, залитого в парафин.

Чтобы исследовать внутриопухолевую гетерогенность промоторного гиперметилирования, мы выполнили MS-MLPA для 24 установленных генов-супрессоров опухолей (26 локусов) на множественных пространственно разделенных образцах, полученных из 21 первичного рака молочной железы. Многорегиональный анализ, представляющий по меньшей мере два и максимум пять опухолевых блоков на пациента и четыре опухолевых области на опухолевый блок, предоставил доказательства внутриопухолевой гетерогенности между различными блоками одной и той же опухоли и в меньшей степени между различными областями в одном опухолевом блоке.

материалы и методы

материал

Настоящее исследование было выполнено ретроспективно на архивной ткани первичной карциномы молочной железы от 21 пациента, перенесшего операцию в период между 2010 и 2011 годами в Университетском медицинском центре Утрехта. Отобранные первичные протоковые карциномы молочной железы были достаточно большими (в среднем 3 см, в диапазоне 1, 2–4, 9), чтобы можно было взять образцы нескольких отдельных областей, каждая из которых имела диаметр 3–6 мм, для эпигенетического анализа. Средний возраст составлял 60 лет (диапазон 44–81 года), средний индекс митотической активности составлял 13 (диапазон 1–50), и все опухоли, за исключением одной, были положительными по эстрогеновым рецепторам. Восемь опухолей были высокой степени (38%), девять — средней степени (43%) и четыре — низкой степени (19%). Четырнадцать пациентов имели метастазы в лимфатические узлы (67%). Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами. Анонимное использование избыточной ткани в исследовательских целях является частью стандартного соглашения о лечении с пациентами в Университетском медицинском центре Утрехта. 23

Отбор проб и экстракция ДНК

Срезы по четыре микрометра вырезали из каждого фиксированного в формалине парафинового блока ткани и окрашивали гематоксилином и эозином. Срез гематоксилина и эозина использовали для регистрации преинвазивных поражений, некроза и смешанного лимфоцитарного инфильтрата, а также для направления микродиссекции для выделения ДНК. Для выделения ДНК на основе протеиназы К были вырезаны пять слайдов толщиной 10 мкм , и участки опухоли были микродиссектированы с помощью скальпеля. Как показано на рисунке 1, для каждого пациента один опухолевый блок был разделен на четыре неперекрывающиеся области примерно одинакового размера, и ДНК была выделена из каждой из них отдельно и из опухолевого блока в целом. Другие опухолевые блоки от того же пациента были также проанализированы в целом. Когда это было возможно, использовали непоследовательные опухолевые блоки. Участки с некрозом, плотными лимфоцитарными инфильтратами и преинвазивными поражениями были намеренно исключены. Концентрацию и поглощение ДНК при 260 и 280 нм измеряли с помощью спектрофотометра (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific).

Схема выборки. От каждой опухоли анализировали от двух до пяти (показано: четыре) предпочтительно непоследовательных опухолевых блоков. Один из опухолевых блоков был дополнительно разделен на четыре неперекрывающиеся области примерно одинакового размера, и ДНК извлекалась из каждого из них отдельно и из опухолевого блока в целом. Другие опухолевые блоки также были проанализированы в целом.

Изображение в полном размере

МС-ММПУ

MS-MLPA выполняли в соответствии с протоколом производителя с использованием зонда SALSA MS-MLPA ME001-C1. Опухоль-супрессор-1, содержащего 15 контрольных зондов и 26 HhaI-чувствительных зондов против TP73, CASP8, VHL, RARB, MLH1 (2 локуса), RASSF1A. (2 локуса), FHIT, APC, ESR1, CDKN2A / B, DAPK1, PTEN, CD44, GSTP1, ATM, CADM1, CDKN1B, CHFR, BRCA1 / 2, CDH13, HIC1 и TIMP3 . По меньшей мере 50 нг ДНК использовали в каждой реакции MS-MLPA. Все реакции проводили в 96-луночном термоциклере Veriti (Applied Biosystems). 100% метилированный (обработанный sssI метилтрансферазой) контроль и отрицательный контроль (ДНК спермы человека) брали вместе в каждом опыте MLPA. Разделение фрагментов проводили капиллярным электрофорезом на капиллярном секвенаторе ABI-3730 (Applied Biosystems). Модели пиков, полученные из Genescan Analysis, были оценены с использованием программного обеспечения Genemapper (версия 4.1) и программного обеспечения Coffalyser (версия 9.4, MRC-Holland). Результаты считались достоверными, если число контрольных проб в пределах нормального диапазона (коэффициент дозировки> 0, 7) составляло ≥12. Образец считали метилированным, когда коэффициент дозировки был> 0, 15, как и раньше. 18

Установление MLPA Критериев гетерогенности

Образцы, взятые из каждой опухоли, оценивали на гетерогенность в каждом локусе путем расчета стандартного отклонения и разницы между максимальной и минимальной частями дозировки. Фактор гетерогенности дозы считали присутствующим, если стандартное отклонение (sd) между различными областями и блоками от одной и той же опухоли было> 0, 07. Это число представляет максимальный sd, наблюдаемый для любого локуса без метилирования между повторными или межпроизводными измерениями MS-MLPA. Поскольку известно, что sd выше в высоко метилированных локусах (максимум sd 0, 18), также сообщалось о влиянии гетерогенности на вызов статуса метилирования.

Статистика

Для оценки вклада внутри опухоли (между блоками, а также внутри блоков) и дисперсии между опухолями к общему отклонению, наблюдаемому в значениях коэффициента дозировки, была использована общая линейная модель (для вложенного несбалансированного ANOVA с ошибкой типа III), Для оценки связи гетерогенности с клинико-патологическими переменными использовался критерий χ2. Все статистические расчеты были выполнены с использованием статистики IBM SPSS 21.

Результаты

Дополнительная таблица 1 показывает результаты MS-MLPA для всех проанализированных областей опухоли и опухолевых блоков. Метилирование в одном или нескольких субрегионах опухоли часто наблюдалось для APC (90%), RASSF1A (81%), CDH13 (76%), CDKN2B (57%) и GSTP1 (52%). Метилирование DAPK1 (33%), TP73 (14%), ESR1 (10%) и CDKN1B (5%) встречалось реже.

Частота неоднородности

На основании критерия стандартного отклонения> 0, 07, 20/21 (95%) опухоли молочной железы показали внутриопухолевую гетерогенность в одном или нескольких исследованных локусах (таблица 1, рисунок 2). Наиболее гетерогенными локусами, обнаруживаемыми MS-MLPA с понижающейся частотой, были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%). Все остальные локусы не показали внутриопухолевой гетерогенности ( CASP8, VHL, RARB, MLH1, ATM, FHIT, CDKN2A, PTEN, CD44, IGSF4, CHFR, BRCA1 / 2, HIC1, TIMP3 ). Эта гетерогенность приводит к изменению статуса метилирования (частичное ограничение дозы 0, 15) по крайней мере в одном локусе в 13/20 (65%) опухолях молочной железы. Локусами, пораженными гетерогенностью, приводящей к изменению статуса метилирования между / внутри опухолевыми блоками, были CDKN2B (43% от всех 21 образцов), RASSF1A (14%), APC (10%), GSTP1 (10%), CDH13 (10%), DAPK1 (5%) и CDKN1B (5%). Гетерогенность в метилировании наблюдалась между различными блоками одной и той же опухоли, а также между различными областями в пределах одного и того же блока (рис. 2).

Таблица в натуральную величину

Два образца, показывающие гетерогенность между блоками и внутри блоков при метилировании с помощью MS-MLPA. Ось X показывает 26 локусов, ось Y показывает значения фактора дозировки. Образец 7 (вверху) показывает гетерогенность внутри блока для CDH13 (не приводящую к изменению статуса метилирования) и гетерогенность между блоками для CDKN2B. Образец 19 (внизу) показывает поразительную гетерогенность внутри блока для RASSF1A, APC и DAPK1.

Изображение в полном размере

Относительный вклад гетерогенности между блоками, внутри блоков и между пациентами (между опухолями)

На рисунке 3 показан относительный вклад межопухолевой и внутриопухолевой межблочной и внутриблочной изменчивости в общую дисперсию. Для большинства генов, за исключением TP73, RARB, RASSF1A, FHIT, APC, DAPK1, GSTP1, CDH13 и BRCA1 , относительный вклад межопухолевой и межблочной вариабельности в общую вариабельность между наблюдениями был сходным. Для других генов межопухолевая изменчивость была основной причиной гетерогенности, что дало до 97% модели. Независимо от гена, вклад изменчивости внутри блока был незначительным или не имел значения (не более 11%).

Относительный вклад дисперсии между опухолями и внутриопухолями между блоками и внутриблоковой изменчивостью.

Изображение в полном размере

Гетерогенность и клинико-патологические переменные

Степень гетерогенности, определяемая количеством гетерогенных локусов в образце, не коррелировала ни с одной из клинико-патологических переменных (степень, состояние лимфатического узла, митотический индекс, размер опухоли, возраст или статус HER2).

обсуждение

В свете многообещающего биомаркерного потенциала оценки метилирования при раке молочной железы в этом исследовании использовалась региональная микродиссекция опухолей молочной железы, чтобы выяснить, может ли MS-MLPA обнаруживать эпигенетически различные субпопуляции в географически различных опухолевых секторах (блоках и участках). Результаты метилирования были гетерогенными (в 1 или более локусах) между различными субрегионами опухоли во всех, кроме одной из исследованных карцином молочной железы (95%). Степень гетерогенности варьировала между исследуемыми опухолями молочной железы, варьируя от одного гетерогенного локуса (4%) до шести гетерогенных локусов (23%) на опухоль. Наиболее гетерогенными локусами, обнаруживаемыми MS-MLPA с понижающейся частотой, были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%). Все остальные локусы не показали внутриопухолевой гетерогенности. Наблюдаемая гетерогенность не всегда приводила к изменению статуса метилирования между различными областями опухоли; гетерогенность приводит к изменению статуса метилирования по меньшей мере в одном локусе в целых 65% опухолей молочной железы.

Гетерогенность в метилировании наблюдалась между различными блоками, а также между различными областями одного опухолевого блока, но на основе общей линейной модели вклад изменчивости внутри блока в общую вариабельность коэффициента дозы между образцами и внутри них был минимальным. Для TP73, RARB, RASSF1A, FHIT, APC, DAPK1, GSTP1, CDH13 и BRCA1 изменчивость между опухолями была основной причиной общей гетерогенности, составляющей до 97% в модели. Для всех других генов, включая CDKN2B , относительный вклад межопухолевой и межблочной вариабельности в общую вариабельность между наблюдениями был сходным. Эти результаты свидетельствуют о значительной межиндивидуальной гетерогенности и указывают на гораздо большую стабильность на уровне внутри блока по сравнению с уровнем между блоками.

Таким образом, мы продемонстрировали, что клональная эпигенетическая гетерогенность присутствует в большинстве первичных карцином молочной железы и может приводить к нарушению статуса метилирования, вызываемого MS-MLPA, что указывает на то, что анализ одной случайной выборки не может быть репрезентативным для всей опухоли, что может препятствовать обнаружение и проверка эпигенетического биомаркера. Межопухолевая гетерогенность была, тем не менее, более выраженной, чем внутриопухолевая гетерогенность. Хотя ограниченная внутриопухолевая гетерогенность наблюдалась между различными областями в одном опухолевом блоке и могла привести к разбавлению общего сигнала метилирования, гетерогенность между различными блоками одной и той же опухоли была значительно больше и, следовательно, более проблематичной для клинических целей.