Оценка прогностической ценности р53 требует тестирования большого количества образцов у пациентов, включенных в предполагаемые клинические испытания III фазы. Целью данного исследования было определить, можно ли определить статус р53 с помощью функционального анализа дрожжей р53 с использованием предельных количеств материала, которые обычно могут быть получены в проспективных исследованиях III фазы (особенно, когда химиотерапия назначается до операции). Все пациенты, имеющие клинически ощутимую опухоль, которые могут считаться достаточно большими для проведения биопсии с пробой (опухоль груди размером 2 см), были пригодны для этого исследования. На хирургических образцах (мастэктомия или опухолеремия) были проведены две биопсии для резекта и одна предварительная биопсия. Образцы замораживали, а секции криостата брали для гистологии и тестирования р53. Было включено 30 пациентов. Три образца из 90 не дали никаких продуктов ПЦР p53, вероятно, потому, что эти образцы содержали почти полностью волокнистую ткань. Из 87 образцов, которые можно было протестировать, результаты разреза и резкого биопсии были полностью согласованы в каждом случае. p53 можно было определить у 97% пациентов с помощью двойной биопсии. Восемь из 30 тестируемых опухолей были мутантами для р53 (27%). Статус p53 может быть достоверно определен с помощью анализа дрожжей на отдельных замороженных участках биопсий. Гистологическое исследование перед тестированием р53 необходимо для исключения случаев, когда результат р53 может отражать только статус нормальных клеток в биопсии.
Экспериментальные и клинические исследования показали, что противораковые агенты сильно индуцируют апоптоз (Hickman, 1992; Ellis et al, 1997). p53 является ключевым регуляторным геном в апоптотическом пути, и экспериментальные данные показали, что опухоли, содержащие p53 дикого типа, лучше реагируют на антрациклины, чем р53-мутантные опухоли (Lowe et al, 1993, 1994; Gudas et al, 1996). Напротив, большинство исследований in vitro и in vivo показали, что статус p53 не влияет на ответ на таксаны (Woods et al, 1995; Brown, 1996; Jordan et al., 1996; Perego et al., 1996; Wahl et al, 1996 Lanni et al., 1997; O’Connor et al., 1997; Fan et al, 1998).
В совокупности эти экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что статус р53 может помочь предсказать реакцию на химиотерапию антрациклинами или таксанами в клинической практике. В частности, можно сделать гипотезу о том, что мутантные опухоли p53 будут устойчивыми к антрациклину, но чувствительны к таксану. Несколько клинических исследований, посвященных этому вопросу, не продемонстрировали прогностической ценности р53. Два клинических исследования, в которых была оценена последовательность ДНК р53, показали, что статус р53 может быть важным. В первом исследовании было обнаружено, что мутантные опухоли р53 устойчивы к антрациклинам (Aas et al, 1996), а вторая обнаруживает, что мутантные опухоли p53 чувствительны к таксанам (Kandioler-Eckersberger et al., 2000). Однако число пациентов, проанализированных в этих исследованиях, было слишком маленьким для окончательных выводов.
Чтобы окончательно решить этот вопрос при раке молочной железы, мы начали крупное клиническое исследование III фазы (исследование EORTC 10994 / BIG 00-01). Тестирование p53 в контексте клинического испытания фазы III создает серьезные технические и логистические проблемы, заслуживающие комментариев. Во-первых, корреляция одной биологической переменной с ответом на различные методы лечения, минимальный дизайн, чтобы показать прогностический эффект, требует в четыре раза больше пациентов, чем стандартное сравнение двух методов (Peterson and George, 1993). Принимая разумные предположения о вероятных прогностических и лечебных эффектах статуса р53 у пациентов с локально распространенным раком молочной железы, количество пациентов, которые должны были ответить на вопрос p53 / таксана в течение 3 лет, составляет около 1400. Во-вторых, хотя широко доступны иммуногистохимия (IHC) не является лучшим методом оценки статуса p53. Риск ложноположительных и ложноотрицательных результатов выше с IHC, чем секвенирование (Fisher et al, 1994; Sjogren et al, 1996; Duddy et al, 2000). В частности, IHC не обнаруживает мутантов, которые кодируют нестабильные белки (бессмысленные мутации, сращивающие мутации), которые были обнаружены в до 47% мутаций p53 в опухолях молочной железы (Chappuis et al, 1999). Более простые методы на основе структуры ДНК, особенно денатурирующий электрофорез в градиентном геле, являются чувствительными, но требуют секвенирования, чтобы показать, что это изменение не является полиморфизмом или молчаливой мутацией. Секвенирование геномной р53 обычно считается золотым стандартом, против которого следует сравнивать новые методы оценки р53, но полное обнаружение мутаций в фиксированной ткани формалина требует микродиссекции образцов опухолей, отнимающей много времени, когда сотни образцов должны быть протестированы (Хартманн et al., 1997). Мы впервые использовали метод РНК, который обнаруживает функционально важные мутации p53 (Flaman et al, 1995). Мы амплифицируем кДНК р53 с помощью ОТ-ПЦР и затем экспрессируем клонированную ДНК у дрожжей. Если кодируемый р53-белок является диким типом, он активирует транскрипцию репортерного гена. Преимущество этого метода заключается в том, что он тестирует большое количество отдельных клонов, поэтому он может обнаруживать мутантную мРНК р53 в клинических образцах, которые содержат значительное количество нормальной ткани. Также возможно протестировать большое количество образцов, необходимых для ответа на клинические вопросы, такие как роль р53 в реакции таксана. Несмотря на то, что расщепление РНК, опосредованное нонсенсом, затрудняет обнаружение мутаций, ограничивающих цепь, с использованием метода на основе РНК, мы показали, что анализ дрожжей особенно хорош при обнаружении этого типа мутации (Chappuis et al, 1999). В-третьих, сбор образцов таким образом, который сохраняет целостность РНК, является серьезной проблемой в многоцентровом клиническом исследовании. Ранее мы показали, что статус р53 может быть точно определен из замороженных участков разрезных биопсий от опухолей молочной железы (Chappuis et al, 1999). Пациенты с большими оперативными или локально развитыми / воспалительными раками молочной железы будут иметь право участвовать в исследовании EORTC 10994 / BIG 00-01. Нынешняя практика в этой группе пациентов заключается в том, чтобы использовать биохимические проколы, а не биопсии. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы определить, возможно ли тестировать p53 статус опухолей молочной железы с помощью дрожжевого анализа в условиях, сходных с теми, которые относятся к этому клиническому испытанию EORTC.
Разрешение на исследование было предоставлено Комитетом по этике в больницах Женевского университета. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании. Мастэктомию или образцы опухолеобразования в группе из 30 пациентов были взяты из операционной в отделение патологии с минимальной задержкой и взяты три биопсии (две эксклюзионные биопсии с иглой 14G и одна пункционная биопсия). Исследование проводилось на хирургически резецированной мастэктомии или образцах опухолеобразования, поскольку этические проблемы исключают множественную выборку опухолей для исследовательских целей у живых субъектов. Биопсии внедряли в ОКТ и немедленно замораживали в 2-метилбутане. Образцы для рутинной диагностики брались параллельно и фиксировались в формалине. Гистологическая оценка всех образцов проводилась одним и тем же патологом (MF Pelte). Анализ дрожжей проводили на замороженных срезах на 100 мкм, по существу, как описано Chappuis et al (1999). мРНК очищали с использованием олиго-dT Dynabeads (Dynal). Общая РНК была очищена с помощью Trizol (Life Technologies). В качестве ПФУ-полимеразы использовали ПФУ-турбо-полимеразу (стратаген). Чтобы исключить снижение достоверности этого фермента, вызванного проприетарной модификацией, мы провели анализ достоверности полимеразы (Flaman et al, 1994). В соответствии с утверждениями изготовителя мы не могли обнаружить разницы в точности Pfu и Pfu turbo (данные не показаны). Поэтому мы использовали турбину Pfu для настоящего исследования. Более высокая процессировка означала, что фрагмент кДНК p53 1 кб можно амплифицировать так же эффективно, как меньшие фрагменты, используемые для раздельной версии дрожжевого анализа (Waridel et al, 1997). Поэтому мы использовали только обычную форму анализа, в которой продукт PCR p53 размером 1 kb был заменен на дрожжевой экспрессирующий вектор pRDI-22 (Waridel et al, 1997).
Секвенирование проводили на минимум четырех плазмидах, спасенных из разных колоний для каждой мутантной опухоли р53. Секвенирующие праймеры были либо IF12, либо IR13 (Chappuis et al, 1999), либо IF216 и IR217 (таблица 1Table 1PCR и секвенирующие праймеры), которые лежат в начале и конце открытой рамки считывания p53 и позволяют упорядочить всю открытую рамку считывания в один запуск на секвенсере Licor 4200L. Каждая плазмида была секвенирована только на одной цепи, но каждая мутация была визуализирована на обеих нитях.
Чтобы испытать образец 17В с помощью микродиссекции, одну замороженную секцию рассекали с помощью лазерного микродиссектора Leica. Геномную ДНК экстрагировали расщеплением протеиназой K, амплифицировали вложенной ПЦР, а экзоны 4-7 секвенировали непосредственно (см. Таблицу 1 для праймеров).
Количественную ПЦР для GAPDH проводили на ПЦР-машине PE5700 с использованием праймеров gaaggtgaaggtcggagtc, gaagatggtgatgggatttc и Taqman probe caagcttcccgttctcagcc. кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы Superscript (Life Technologies), как и для p53 (Chappuis et al, 1999), за исключением того, что использовали гексамеры и амплифицировали с использованием основного микса Taqman PCR (Perkin-Elmer).
Одним критическим параметром в тесте является фоновое число красных колоний. Это определяет максимально допустимое загрязнение образцов опухолей генетически нормальными клетками. Гистологическое исследование показало, что в большинстве образцов мало или вообще нет нормальной ткани молочной железы, но все они содержали значительное количество генетически нормальных клеток, главным образом фибробластов, воспалительных клеток и эндотелиальных клеток. В образцах часто содержались большие фиброзные бесклеточные области, причем опухолевые клетки присутствовали на небольших островах. Точная оценка количества или доли опухолевых клеток чрезвычайно сложна в таком гетерогенном материале. Наблюдаемое распределение красных колоний было использовано для определения реального фона с помощью клинических образцов. Причинами изменения фона являются такие факторы, как ошибки РНК-полимеразы, артефакты сращивания, ошибки обратной транскриптазы, ошибки полимеразы Пфу, изменение количества входной РНК, артефакты клонирования ремонта дефектов, рекомбинация в локусе репортера и генетические супрессоры дрожжей leu2- 3112. Если предположить, что они происходят по существу случайным образом, мы должны увидеть два наложенных распределения в результатах: нормально распределенная популяция, полученная из образцов дикого типа, наложенная на более плоское распределение, полученное из образцов мутантов р53. Последнее может принимать любое значение выше фона, в зависимости от количества нормальной ткани в образце. Это именно то, что наблюдается. Рисунок 1Настроенная 1H-диаграмма, показывающая распределение процента красного для дрожжевых анализов на замороженных участках опухолей молочной железы. Средний фон с образцами дикого типа составляет 5% красных колоний (см. Текст).
Мутации ТР53 — одно из самых частых событий в клетках злокачественных новообразований. По различным данным, от 50 до 80% солидных опухолей имеют различные повреждения ДНК в данном гене, около 90% из которых — миссенс мутации, то есть ведут к изменению структуры белка.
Апоптоз и злокачественные опухоли
Образование любой злокачественной опухоли сопряжено с нарушением механизмов апоптоза (программируемой клеточной гибели), которые контролируются белком р53. Его нормальное функционирование препятствует бесконтрольному делению неполноценных клеток. Если в результате какого-либо воздействия (облучения, химических веществ), в клетке возникают повреждения молекулы ДНК, белок р53 остановит ее деление до устранения повреждения, либо активирует ее программируемую гибель до того, как она успеет поделиться.
Данный механизм работает до тех пор, пока ген ТР53 имеет нормальную структуру. Когда в нем возникают мутации, в клетке накапливается мутантный белок, который не может выполнять свою основную функцию. Это нарушает механизмы включения апоптоза, что проявляется развитием новообразований, а при их существовании — способствует возникновению резистентности опухолевых клеток к проводимой химиотерапии.
Методы диагностики
На сегодняшний день существует несколько основных методов, позволяющих выявить наличие повреждений ДНК в гене ТР53:
- Секвенирование. В результате анализа происходит расшифровка последовательности целого гена, что позволяет найти все существующие в нем мутации. Они могут возникать как в нормальных клетках, увеличивая вероятность злокачественной трансформации, так и в опухолевых, что предопределяет дальнейшее прогрессирование новообразования. Данный метод применяется при подозрении на наследственные синдромы, когда мутации в гене являются инициирующим событием. В остальных случаях существуют значительные сложности с интерпретацией выявленных повреждений ДНК.
- Иммуногистохимический анализ (ИГХ). Данный метод исследования является основным в клинической практике. Он позволяет оценить экспрессию в исследуемой ткани белка р53, увеличение концентрации которого говорит о нарушении в работе соответствующего гена и, как правило, сопряжено с высокой пролиферативной активностью клеток (что позволяет дифференцировать дисплазии и злокачественные опухоли) и чаще всего является признаком неблагоприятного прогноза.
Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) для поиска повреждений ДНК в гене ТР53 является несколько устаревшим. В настоящее время используется он очень редко, когда необходимо подтвердить наличие или отсутствие конкретной мутации. Однако в связи с большим их разнообразием, в диагностическом процессе при наличии такой необходимости, в настоящее время предпочтение отдается полногеномному секвенированию.
Иммуногистохимический метод позволяет косвенно оценить состояние гена ТР53 по концентрации белка р53, которая для разных тканей в норме может значительно отличаться. Поэтому заключение о наличии нарушения делает морфолог.
Для проведения ИГХ, на первом этапе выполняется биопсия. Затем полученная ткань фиксируется на стекле, к ней добавляются специфические антитела, меченные красителем. Результаты могут быть оценены при помощи обычного светового микроскопа.
Таким образом, по количеству связанного красителя в ткани можно визуально оценить содержание белка. Система оценки двумерная:
- Оценивается интенсивность окраски от 0 до 3 баллов. При этом 0 баллов — окраска отсутствует, а 3 — сильное окрашивание.
- Оценивается доля окрашенных клеток, которая в зависимости от числового значения переводится в баллы.
В заключение отметим, что поскольку организм — сложная система, то мутации в одном гене лишь повышают вероятность, но не гарантируют развитие опухоли в организме. Поэтому любое исследование, показавшее то или иное нарушение в работе гена ТР53 должно быть интерпретировано доктором в комплексе с учетом клинической картины и использованного метода.
Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Глухова Е. И., Лукашина М. И., Богатырев В. Н., Барышников А. Ю.
Е. И. Глухова, М. И. Лукашина, В. Я. Богатырев,
ЭКСПРЕССИЯ Р53, BCL-2 И FAS (APO-1/CD95) ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
НИИ клинической онкологии,
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Заболеваемость и смертность от рака молочной железы (РМЖ) среди женщин в нашей стране имеет тенденцию к неуклонному росту. В структуре онкологической заболеваемости женского населения и в России и в других наиболее развитых странах Европы и США РМЖ занимает одно из первых мест [1, 6, 7]. При этом отмечаются постоянный рост уровня заболеваемости, а также выявление больных с начальными стадиями заболевания.
В этой связи разработка и внедрение в клиническую практику ранней диагностики и эффективных методов лечения продолжают оставаться важным разделом проблем борьбы со злокачественными опухолями.
С помощью раннего выявления заболевания, профилактики и адекватного лечения ранних форм РМЖ может быть достигнуто сокращение смертности. В связи с этим особое значение приобретает изучение клинического течения, лечения и факторов прогноза РМЖ, таких, как экспрессия онкобелков и гликопротеинов, контролирующих апоптоз.
В настоящее время идентифицировано и достаточно подробно изучено несколько онкогенов, ассоциированных с различными опухолями, в том числе с РМЖ: р53, bcl-2, с-егЬВ2, с-тус и др. [2,17,18, 23, 24, 31, 37, 49].
Ген р53 является одним из наиболее изученных представителей группы генов-супрессоров опухолевого роста и занимает важное место в системе генов, ответственных за процессы репарации ДНК перед началом клеточного деления, регуляцию клеточного цикла и апоптоз [2—5, 8, 32, 39, 40, 48]. Он локализован на 17-й хромосоме (17ql3) и кодирует фактор активации транскрипции, который действует как негативный регулятор роста клеток. Р53 представляет собой полифункци-ональный белок, основная функция которого осуществляется в ядре. Нарушения функций р53 в результате точечных мутаций, делеций, образования комплекса с другим клеточным регулятором или изменения субклеточной локализации приводят к утрате супрессивных свойств и стимулируют опухолевый
E.I.Glukhova, M.I.Lukashina, VN.Bogatyrev, A.Yu.Baryshnikov
EXPRESSION OF P53, BCL-2 AND FAS (APO-1/CD95) IN BREAST CANCER
Institute of Clinical Oncology,
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors
Breast cancer (BC) accounts for continuously increasing morbidity and mortality of women in this country and abroad. BC is one of the commonest female malignancies in Russia and other most developed European countries and the USA [1,6,7]. There is also a rise in BC incidence and detection of patients with early disease.
Development and practical application of effective methods for early diagnosis and treatment of cancer is an important area of cancer control.
BC mortality may be reduced through early detection, prevention and adequate treatment of early cancer, and of particular importance is therefore study of clinical course, treatment and prognosis factors of BC such as expression of oncoproteins and glycoproteins that control apoptosis.
There are several oncogenes associated with various tumors including BC that are identified and rather well studied such as p53, bcl-2, c-erbB2, c-myc and others [2,17,18,23,24,31,37,49].
Gene p53 is a best studied representative of tumor growth suppressors that plays an important role among genes responsible for DNA reparation before cell division cell, cycle regulation and apoptosis [2-5,8,32,39,40,48]. It is localized in chromosome 17 (17ql3) and encodes transcription activation factor that acts as a down-regulator of cell growth. The p53 is a multifunctional protein with its most important function performed in the nucleus. Impairment of p53 functioning as a result of point mutations, deletions, binding to another cell regulator or alteration in subcellular location leads to reduction in its suppressive capacity and enhances tumor growth. Amplification of chromosome locus 17ql3 is often found in advanced breast tumors but is not associated with poor prognosis. Mutations in the p53 are a commonest genetic aberration found in a variety of tumors [3,4,8,35,45]. Mutations of wild (normal) p53 type result in generation of a mutant gene p53 (p53mt), and the cell loses the ability of apoptosis. The p53 was
I the first mutant gene identified in hereditary sarcomas and
процесс. Амплификация хромосомного локуса 17ql3 часто встречается на поздних стадиях опухоли молочной железы (МЖ), но не ассоциирована с плохим прогнозом. Мутации в р53 — наиболее частое генетическое нарушение, регистрируемое в самых различных опухолях [3, 4, 8, 35, 45]. В результате мутаций дикого (нормального) типа р53 образуется мутантный тип гена р53 (p53mt), и клетка теряет способность к апоп-тозу. Р53 был первым мутантным геном, идентифицированным в наследственных формах сарком и РМЖ при наследственном синдроме Li-Fraumeni [24]. По некоторым оценкам, 1% женщин в возрасте до 40 лет с первичным РМЖ имеют герминальную мутацию этого гена. Соматические мутации регистрируются в 53—86% случаев [2]. В инвазивных опухолях МЖ наличие мутаций р53 коррелирует с низким уровнем дифференцировки, снижением количества рецепторов эстрогена и высоким пролиферативным индексом клеток [30]. Последовательное накопление мутаций р53 обеспечивает опухоли более быстрый и инвазивный рост, который прекращается лишь со смертью организма.
Протоонкоген bcl-2 впервые был выделен из точки разрыва транслокаций между 14-й и 18-й хромосомами и обнаружен в большом количестве в различных лимфомах. Была установлена его биологическая функция, которая заключается в способности блокировать апоптоз [41, 42]. В семейство bcl-2 входят bcl-2, bcl-6, bax, bak, bad, одни индуцирующие, другие ингибирующие апоптоз. 1Ън bcl-2 в настоящее время считают основным ингибитором апоптоза. Он представляет собой онкоген, локализующийся в хромосоме человека 18q21 [27, 28]. Обнаружение bcl-2 во многих компартаментах клетки (митохондриальная мембрана, эндоплазматический ретикулум и ядро) указывает на важную роль этого протоонкогена в модуляции поступающих сигналов [И, 14, 38]. Гиперэкспрессия гена bcl-2 предотвращает характерные морфологические признаки апоптоза. Клетки, в которых гиперэкспрессия гена блокирует апоптоз, устойчивы к действию индукторов клеточной гибели и могут длительно сохранять жизнеспособность даже без факторов роста в культуре [25, 29]. При этом повышается чувствительность к мутагенным сигналам. IfeH bcl-2 в таких условиях является онкогеном, обусловливающим клеточное перерождение и развитие злокачественных опухолей.
Другой ген — Аро-1 — характеризуется эффектом, противоположным гену bcl-2, а его продукт Fas может индуцировать апоптоз [10]. Fas-лиганд передает сигнал программированной клеточной гибели через CD95(Fas/APO-l)-penenTop, включающий каскад передачи сигнала смерти. В связи с этим в последнее время активно изучается СБ95-рецепторно-лиганд-ная система с целью выявления экспрессии этого антигена на опухолевых клетках, его функционального состояния и возможности воздействия на CD95(Fas/APO-l)-aHTHreH с терапевтической целью.
Из изложенного ясно, что анализ апоптоза, экспрессии р53, p53mt и bcl-2 позволяет получить молекулярно-генетическую характеристику популяций клеток РМЖ, которая может быть полезна для прогноза и лечения РМЖ.
Материалы и методы. В данной работе проведено иммуноцитохимическое изучение экспрессии онкобелков (CD95, bcl-2, p53mt, р53рап) при РМЖ.
В качестве объекта исследования использовался операционный материал от больных РМЖ, проходивших лечение в клинике РОНЦ им. Н. Н. Блохина
BC in patients with hereditary Li-Fraumeni syndrome [24]. As reported, about 1% of women under 40 years of age with primary BC have germinal mutation of this gene. Somatic mutations are found in 53-86% of the cases [2]. The presence of p53 mutations in invasive cancer is related to poor differentiation, low content of estrogen receptors and high index of cell proliferation [30]. Successive accumulation of p53 mutations provides a more rapid and invasive tumor growth that stops only upon the patient death.
Protooncogene bcl-2 was first isolated from the point of translocation break between chromosomes 14 and 18 and is found in a large amount in various lymphomas. Its biological function is to block apoptosis [41,42]. The bcl-2 family includes bcl-2, bcl-6, bax, bak, bad with some of the genes being initiators and others inhibitors of apoptosis. The gene bcl-2 is considered the principal apoptosis inhibitor. It is an oncogene located in human chromosome 18q21 [27,28]. The presence of bcl-2 in many cell compartments (mitochondrial membrane, endoplasmic reticulum and nucleus) is evidence of its significant role in signal modulations [11,14,38]. Hyperexpression of the bcl-2 prevents characteristic signs of apoptosis. Cells in which apoptosis is blocked due to bcl-2 hyperexpression are refractory to cell death inducers and preserve viability for a long time even in cultures free from growth factors [25,29]. The sensitivity to mutagenic signals is increasing. Under these conditions the bcl-2 is an oncogene responsible for cell regeneration and development of malignant tumors.
Another gene, Apo-1, produces an opposite to bcl-2 effect and its product Fas may induce apoptosis [10]. Fas ligand transmits apoptosis signal through CD95 (Fas/Apo-1) receptor that switches on the death signal transmission cascade. There is a vast study of CD95 receptor-ligand system aimed to detect expression of this antigen on tumor cells, to establish its functional status and the possibility to influence CD95(Fas/Apo-l) antigen for therapeutic purposes.
So, study of apoptosis, p53, p53mt and bcl-2 expression will provide molecular-genetic characterization of BC cell populations that may be useful for BC prognosis and treatment.
Materials and Methods. This paper describes an immunochemical study of expression of oncoproteins (CD95, bcl-2, p53mt, p53pan) in BC.
The study was performed on surgical specimens from BC patients managed at the N.N.BIokhin CRC during June 1999 to February 2000. The patients underwent surgery consisting of modifications of radical mastectomy. Most patients were aged 31 to 79 years.
We analyzed 100 breast tumor specimens including 71 ductal infiltrative carcinomas (29 with and 42 without metastases); 14 lobular infiltrative carcinomas; 6 tubular carcinomas; 3 Paget carcinomas; 3 mixed carcinomas (ductal and lobular); 1 mucinous carcinoma, 1 medullar carcinoma, 1 phylloid tumor.
Tumor specimens were taken daring operation or by punch biopsy, then touch smears were prepared and dried in air for 30-60 min. To perform cytological verification one specimen underwent Leishman’s staining and the remaining specimens were wrapped up in foil and left in refrigerator at -20°C for 24 hours or longer. Before the reaction the cytological specimens were taken out from the refrigerator and left in foil to warm up to room temperature. After that the smears were fixed in cooled acetone 1-2 min to be tested for reactivity by indirect and direct immunofluorescence with monoclonal antibodies (MAb) anti-bcI-2 (Dako, Boehringer Mannheim), anti-p53, FITC conjugated (Dako), CD95 (ICO-I6O) and ICO-25 (Medbiospectr) using an Opton (FRG) microscope. To detect intracellular oncoproteins (bcl-2, p53) the sections were treated with 1% triton X-100 at 4°C for 1-2 min, washed two times in PBS (pH 7.4) and treated with 1% BSA for 15-20 min; after removal of BSA the specimens were treated with MAb in working dilutions. After 16-18 hours of incubation at 4°C the specimens were
Таблица 1 Table 1
Экспрессия биомаркеров в разных гистологических группах РМЖ Biomarker expression with respect to ВС histology
Маркер Экспрессия Инфильтративный протоковый рак Инфильтративный дольковый рак Редкие формы рака P
Тел.: +7 (727) 222-21-01, e-mail: info@prg.kz, Региональные представительства
Для покупки документа sms доступом необходимо ознакомиться с условиями обслуживания
 |
ВНИМАНИЕ! Услуга для абонентов NEO, Tele2 временно недоступна |
|
ВНИМАНИЕ! Услуга для абонентов Beeline, NEO, Tele2 временно недоступна |
Стоимость услуги — тенге с учетом комиссии.
Клиническое значение мутаций р53 при раке грудной железы (обзор литературы)
Рак грудной железы (РГЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин. В 2008 г. во всем мире зарегистрировано 458 503 случая летального исхода от этой патологии. Прогноз течения у больных с локализированными формами РГЖ зависит от клинических, морфологических и биологических характеристик опухоли, таких как: возраст на момент установления диагноза, размер опухоли, наличие метастазов в регионарных лимфоузлах, степень дифференцировки опухоли, экспрессия опухолью рецепторов к эстрогенам (ЕР) и прогестерону (ПР), гиперэкспрессия Her2/neu, а также митотический индекс (Ki-67). Совокупность перечисленных выше прогностических факторов определяет тактику консервативного лечения больных РГЖ.
Увеличение выживаемости пациенток с локализированным (неметастатическим) РГЖ, получавших адъювантную лекарственную терапию, доказано еще в 1980-х годах, особенно у больных младше 50 лет. В адъювантном режиме чаще всего используются антрациклин-содержащие программы с добавлением трастузумаба у больных с гиперэкспрессией Her2/neu. У пациенток с гормоночувствительными опухолями назначение в адъювантном режиме антиэстрогенов или ингибиторов ароматазы снижает риск возникновения рецидива опухоли. Эти же подходы используются для определения тактики лекарственной терапии пациенток с метастатическим РГЖ, что позволяет увеличить общую выживаемость. Однако, по различным данным, у 20-40% больных РГЖ встречаются опухоли первично-резистентные к стандартной лекарственной терапии. Этот факт побуждает к поиску факторов, отвечающих за первичную резистентность, и разработке терапевтических подходов, направленных на ее преодоление.
Белок р53 обнаружен тремя группами исследователей (под руководством A. Levine, P. May и L. Old) в 1979 г. как ключевой регулятор клеточного цикла. Основными биологическими эффектами активированного р53 являются: задержка клеточного цикла в конце фазы G1, что в зависимости от силы раздражителя приводит к репарации ДНК или запуску апоптоза, ингибирование ангиогенеза (рисунок). В 1989 г. группа ученых под руководством B. Vogelstein обнаружила, что ген, кодирующий синтез белка р53 (ТР53), в клетках различных злокачественных опухолей человека инактивируется. Мутации ТР53, приводящие к инактивации р53, по разным данным, наблюдаются в 20-30% карцином грудной железы и являются причиной первичной резистентности к стандартной системной терапии.
Рисунок. Биологические эффекты активации белка р53
detector