Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Задуманные и разработанные эксперименты: JLD VG HV. Выполняли эксперименты: HV VG JLD. Проанализированы данные: HV VG JLD FG. Написал документ: HV VG JLD FG. Выполнены in vivo эксперименты и статистический анализ: HV JLD.
Муцин MUC5B имеет критическую защитную функцию в нормальных легких, слюнных железах, пищеводе и желчном пузыре, и, как сообщается, аберрантно выражается в раке молочной железы, второй ведущей причиной смертей от рака среди женщин во всем мире. Чтобы лучше понять влияние MUC5B на патогенез рака, просветную линию клеток MCF7 рака молочной железы человека трансфицировали вектором, кодирующим рекомбинантный мини-муцин MUC5B, и затем заражали вирусом для доставки короткой шпилечной РНК, чтобы сбить мини- муцин. Пролиферативные и инвазивные свойства в Matrigel субклонов и субпопуляций MCF7 оценивали in vitro. Модель ксенотрансплантата была установлена путем подкожной инокуляции клонов MCF7 и субпопуляций у мышей SCID. Измеряли рост опухоли, а опухоли и метастазы оценивали гистологическим и иммунологическим анализом. Мини-муцин MUC5B способствовал пролиферации и инвазии клеток MCF7 in vitro. Эксперименты ксенотрансплантата показали, что мини-муцин способствует росту опухоли и распространению клеток MCF7. В заключение, экспрессия MUC5B связана с агрессивным поведением MCF7 клеток рака молочной железы. Это исследование показывает, что MUC5B может представлять собой хорошую мишень для замедления роста опухоли и метастазов.
Муцины представляют собой высокомолекулярные O-гликозилированные белки, присутствующие на поверхности большинства эпителиальных клеток. Человеческие муцины классифицируются структурно в два семейства: связанные с мембраной муцины (MUC1, MUC3A / B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC16 и MUC17) и секретируемые или гелеобразующие / полимеризующиеся муцины (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6 и MUC19) [1] — [3]. Секретируемые муцины включают амино- и карбокси-концевые области, которые разделяют сходные домены с коэффициентом про-фон Виллебранда. Эти муцины полимеризуются через эти области с образованием длинных полимеров, которые секретируются в просвете многих органов. Центральная часть муцинов содержит большие области, обогащенные гидроксиаминокислотами и пролинами (Ser / Thr / Pro), которые широко замещены O-гликанами. Эти последовательности Ser / Thr / Pro различаются по размеру и последовательно между муцинами, не сохраняются между видами и обычно организованы в тандемных повторах (TR). Во многих полимеризующихся муцинах эти тандемно повторяющиеся последовательности связаны или прерываются голой и гидрофобной областью, богатой остатками цистеина и называемой CYS-доменом [4].
Мы широко охарактеризовали структуру гена MUC5B человека [5] — [7]. Центральная часть MUC5B состоит из трех чередующихся поддоменов: (i) субдомен по имени R, найденный пять раз и выполненный из повторений нерегулярного повторения 29 аминокислот (aa), богатых Ser, Thr и Pro; (ii) сохраняющийся субдомен 111aa, называемый доменом R-конца, и найденный четыре раза; и (iii) высококонсервативный домен, названный CYS-доменом [4], который составляет около 110 а.о. и обнаружен семь раз в белке MUC5B. Переменный домен CYS / R-домен / R-конец создает большую составную повторную единицу 528 aa [6].
Рак молочной железы является второй ведущей причиной смертей от рака у женщин во всем мире [8]. Мюцин MUC1, связанный с мембраной, является наиболее изученным муцином при раке молочной железы [9] и является наиболее широко изученным муцином для разработки терапии для лечения рака молочной железы [8]. Среди четырех полимеризующихся муцинов MUC2, MUC5B, MUC5AC и MUC6, чья измененная экспрессия была зарегистрирована в тканях рака молочной железы, роль MUC5B плохо документирована. Только несколько исследований были сосредоточены на MUC5B. Муцин был обнаружен иммуногистохимией в первичных опухолях молочной железы (81%) и в образцах нормального появляющегося грудного эпителия, прилегающих к раковым клеткам (42,1%), тогда как MUC5B не был обнаружен в нормальных контрольных образцах молочной железы [10]. MUC5B-мРНК-транскрипты были обнаружены в аспиратах костного мозга 9/46 пациентов (19,5%), которые подверглись первичной резекции опухоли [11], но не в 36 образцах образцов нормальной периферической крови, что указывает на то, что MUC5B может быть специфическим маркером с высокой специфичностью ( 100%) для диагностики распространения рака молочной железы [10], [11]. Чтобы проанализировать роль MUC5B в опухолегенезе молочной железы, мы трансфицировали линию клеток опухоли молочной железы MCF7 [12] с помощью плазмиды, кодирующей муцин MIN-MUC5B, сделанный из большой составной единицы MUC5B со многими O-гликозилированными сайтами и окруженный двумя доменами CYS , Мы обнаружили, что мини-муцин MUC5B способствует клеточной пролиферации и in vitro инвазии опухолевых клеток рака молочной железы. Используя модель мышиной иммунодефицитной мыши, мы показываем, что MUC5B способствует росту опухоли и метастазированию. Эти данные свидетельствуют о том, что MUC5B представляет собой хорошую терапевтическую мишень для замедления роста опухоли и распространения рака молочной железы.
(A) Схематическое представление управляющих векторов Ires-Luc и Mini5B-Luc. Вставка, кодирующая Mini5B, была выполнена с помощью сигнальной последовательности, 11 TR 29 aa, одного R-конца домена 111 aa и двух доменов CYS 110 aa. (B) Используя анализ активности люциферазы, были получены четыре стабильных клона, экспрессирующих трансген Ires-Luc (клоны B2, C5, C7 и C10) и два стабильных клона, экспрессирующих трансген Mini5B-Luc (клоны A3 и D6). (C) экспрессию мРНК MUC5B изучали с помощью qRT-PCR (TaqMan) в линии родительских клеток MCF7 (белая коробка), в клонировании IRE-Luc (MCF7) и в клон Mini5B-Luc (черный ящик). Уровни экспрессии были нормированы на уровни мРНК 18S и показаны как x-fold относительно нормализованной экспрессии гена MUC5B в родительских клетках MCF7. Относительные количества генов-мишеней рассчитывали с использованием метода ΔΔCt. Значения — это среднее ± стандартное отклонение от четырех до шести независимых образцов. (D) MUC5B иммунофлюоресцентный анализ родительских клеток MCF7, клоны Ires-Luc и Mini5B-Luc. Mini5B был секретирован на клеточной поверхности клонов Mini5B-Luc. Ядра были противопоставлены йодидом пропидия. Шкала шкалы 50 мкм. (E) Выражение Mini5B оценивали с помощью RT-PCR. Продукт ПЦР 159 п.о. был обнаружен только в клон Mini5B-Luc. (F) Вестерн-блот-анализ лизатов из клонов Ires-Luc, клонов Mini5B-Luc и субпопуляции Mini5B-Luc CYS shRNA. (G) Было определено количественно ингибирование продукции Mini5B, обнаруженное путем Вестерн-блоттинга. Производство Mini5B клона Mini5B-Luc было установлено на уровне 100, а производство Ires-Luc было установлено на уровне 0.
Клеточная линия MCF7 рака молочной железы человека была приобретена в Американской коллекции типовых культур (ATCC HTB22, полученной из аденокарциномы молочной железы человека). Клетки поддерживали в минимальной существенной среде (MEM) (технологии Invitrogen / Life, Villebon-sur-Yvette, Франция), дополненной 2 мМ l-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 0,1 мМ несущественного аа, 1 мМ пирувата натрия, 0,01 мг / мл бычьего инсулина и 10% фетальной бычьей сыворотки (Thermo Scientific) при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО2.
(A) Кривые роста клонов Mini5B-Luc и Ires-Luc. Данные выражаются как среднее ± SEM. Кривая представляет собой три эксперимента. Для двух клонов было рассчитано удвоение времени. (B) Инвазивные проценты клонов Ires-Luc и Mini5B-Luc и популяции Mini5B-Luc KD. Данные выражаются как среднее ± SEM. Диаграмма представляет собой два эксперимента. (C) Иллюстрация окклюзионных клеток, окрашенных толуидиновым синим. Шкала шкалы 50 мкм.
IRES-Luc (отмеченная в дальнейшем Ires-Luc) кассета, фланкированная двумя сайтами рестрикции EcoRI, была получена путем двухступенчатой ПЦР-амплификации и субклонирована в вектор pCR4 (Invitrogen) с использованием pMG (InvivoGen, Тулуза, Франция) и pGL3 Basic ( Promega, Leiden, The Netherlands) в качестве шаблонов. Люк-последовательность 1,7 т.п.н. амплифицировали с использованием двух олигонуклеотидных последовательностей 5′-AGATCTTACGCGTGCTAGCC-3 ‘(вперед) и 5′-GGATCCGACTCTAGAATTACAC-3′ (обратный), вводящих соответственно BglII и сайт рестрикции BamHI (подчеркнутый). Последовательность Ires 0,7 т.п.н. амплифицировали с использованием двух олигонуклеотидных последовательностей 5’-GAATTCGAACGTAGCTCTAG-3 ‘(вперед) и 5′-AGATCTCCTACCGGTGATCTC-3’ (обратного), введя соответственно сайт рестрикции EcoRI и BglII (подчеркнутый). Использовался пустой эукариотический вектор pcMG и pcMG, несущий последовательность mini5B [13]. Плазмида pcMG является производным плазмиды pcDNA3.1, но промотор был заменен композиционным промотором EF1α-HTLV из pMG и содержит небольшой интрон. Последовательность Mini5B составлена из лигирующей цепи IgK в кадре с двумя идентичными доменами CYS MUC5B, фланкирующими большой участок Ser / Thr / Pro (430 аа) муцина. Кассета EcoRI-EcoRI-Ires-Luc объемом 2,5 кб была субклонирована в уникальный сайт рестрикции EcoRI pcMG или в pcMG-Mini5B, расположенный ниже по потоку от стоп-кодона Mini5B. Использовались только векторы с правильной ориентацией кассеты (pcMG-Ires-Luc и pcMG-Mini5B-Ires-Luc). Mini5B содержит в своей карбокси-концевой последовательности N-гликозилирующий сайт NSS.
(A) Окрашивание ОН проводили на парафиновых срезах печени, легких и лимфатических узлах мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc. Метастаз показан в увеличенном изображении. (B) Иммунофлуоресцентный анализ проводили на парафиновых срезах печени у мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc и окрашивали анти-PCNA-антителом. Метастатические клетки были положительными. (C). Двойной иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител против человеческого E-кадгерина и антител против MUC5B проводили на парафиновых срезах грудных лимфатических узлов у мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc. Метастатические клетки экспрессировали как эпителиальный маркер E-cadherin, так и секретируемый белок MUC5B. Ядра были контрастированы с Hoechst 33258 или йодидом пропидия. Mt, метастазы. Шкала шкалы 50 мкм.
Клетки MCF7 трансфицировали с использованием набора Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, France) с 2 мкг плазмиды pcMG-Mini5B-Ires-Luc или pcMG-Ires-Luc (Luc clone), линеаризованной с помощью уникального рестрикционного фермента SspI. Трансфицированные клетки затем отбирали с помощью аналога неомицина G418 (650 мкг / мл, Invitrogen) в течение 10 дней через ген устойчивости к неомицину вектора pcMG. Клоны, устойчивые к G418, отбирали индивидуально и высевали в 96-луночный планшет для культивирования, расширивали в 48-луночный планшет, затем шестизонный планшет и, наконец, в культуральной колбе на 25 см2.
(A) Mini5B-Luc, Ires-Luc, пурпурная shRNA Mini5B-Luc или ксенотрансплантаты SHRNA Mini5B-Luc CYS. Рост опухоли контролировался один раз в неделю в течение 118 дней. * P 2 мм в наибольшем размере) наблюдались в легких у одной мыши в группе Ires-Luc и у 4/4 мышей в группе Mini5B-Luc (рис.5C и таблица 1) , Напротив, только одна мышь в группе SHRNA Mini5B-Luc CYS показала метастазы в печени (таблица 1). Индекс тяжести заболевания был выше у мышей, которым вводили клетки, экспрессирующие Mini5B (клоны Mini5B-Luc и пустые популяции SH5NA Mini5B-Luc), чем у мышей, которым вводили клетки, которые не экспрессировали группы Mini5B (Ires-Luc и Mini5B-Luc CYS shRNA, P = 0,002) (фиг.6). Эти доклинические данные свидетельствуют о том, что мини-муцин Mini5B способствует росту опухоли и распространению клеток в этой модели s.c. ксенографты.
В физиологических условиях муцины играют защитную роль в эпителиальных тканях и участвуют в процессе эпителиальной дифференциации, регуляции роста, модуляции клеточной адгезии и клеточной передачи сигналов [22]. Многочисленные исследования показали, что аномальное гликозилирование муцина обычно связано со злокачественной трансформацией эпителиальных клеток [9], [23]. Сверхэкспрессия муцинов, наблюдаемая во многих раковых образованиях, важна для адгезии и инвазии раковых клеток, выхода из раковых клеток из иммунной системы, захвата биологических молекул, таких как факторы роста и роста клеток [22].
При некоторых раковых заболеваниях наблюдалась несостоятельная или эктопическая экспрессия муцинов. Это имеет место для MUC5B, который выражается ненормально в желудочных карциноматозных тканях и клеточных линиях [24] и в аденокарциномах легких [25], [26]. В ткани молочной железы белок MUC5B обнаруживается с высокой частотой в тканях рака молочной железы, тогда как муцин не экспрессируется в нормальных контрольных образцах молочной железы [10]. Ранее сообщалось, что все опухоли молочной железы развиваются спонтанно в трансгенном штамме мыши MMTV-ras, продуцированном Muc5b [27]. Среди рака молочной железы люминальный подтип составляет 68% всех случаев рака молочной железы и связан с высоким риском (70%) для развития метастазов [28]. Клеточная линия MCF7, экспрессирующая E-кадгерин, рецептор эстрогена и рецептор прогестерона, считается хорошей моделью для имитации рака молочной железы [29]. Чтобы далее понять последствия MUC5B в патогенезе рака молочной железы, мы трансфицировали клетки MCF7 рекомбинантным мини-муцином MUC5B, и мы оценили инвазивный и метастатический потенциал этих клеток in vitro и s.c. ксенотрансплантата.
Прогнозируемый транскрипт MUC5B составляет 17,9 кб в длину [5] — [7], [24] в соответствии с экспериментами с нозерн-блоттингом [30]. Центральный экзон MUC5B имеет длину 10713 bp и кодирует пептид 3571 aa, состоящий из семи доменов CYS и областей, богатых Ser / Thr / Pro, из муцина, которые несут многочисленные олигосахаридные цепи. Большой размер пептидного фрагмента MUC5B (> 5000 аа) заставил нас исследовать его роль in vitro и in vivo, используя мини-муцин, сделанный из области, специфичной для домена, 650 аа, что является репрезентативным для центральной области полный O-гликозилированный муцин. Ранее было показано, что этот мини-муцин выделяется как N-гликозилированные и экстенсивно O-гликозилированные молекулы, когда вектор трансфицируется в клетках COS-7 [13].
Мы обнаружили, что мини-муцин способствовал пролиферации клеток MCF7 in vitro и инвазии в Матригеле. Эксперименты ксенотрансплантата показали, что мини-муцин, продуцируемый клетками MCF7, заметно влияет на рост опухоли и связан с агрессивным поведением опухоли. Этот вывод согласуется с предыдущими исследованиями о роли другого гелеобразующего муцина MUC2 в раке молочной железы [31] — [33]. Одно исследование показало, что клеточная линия рака толстой кишки LSLiM6 секретирует MUC2, который при инокуляции мышам индуцирует метастазы в печени [34]. Уменьшение экспрессии MUC2 с помощью антисмысловой стратегии ингибирования уменьшало способность клеток колонизировать этот орган.
Сравнение частоты развития опухоли и метастазов между мышами, инъецированными клоном Ires-Luc, и мышами, инъецированными клоном SHRNA Mini5B-Ires-Luc CYS, говорит о том, что лучший результат был для группы SHRNA Mini5B-Ires-Luc CYS. Это удивительно, поскольку мы ожидали подобных результатов для этих двух групп. В то время как экспрессия эндогенного MUC5B казалась весьма схожей между клонами и родительской клеточной линией на уровне гена и уровнем белка, мы не можем полностью исключить, что экспрессия MUC5B дикого типа, которая не должна ингибироваться в клоне Ires-Luc, может быть частично ответственным за наблюдаемые различия.
Функция полимеризации муцинов в биологии рака молочной железы неясна, и механизмы, с помощью которых экспрессия муцина влияет на опухолегенез раковых клеток молочной железы, плохо изучены. Влияние экспрессии муцина на поведение раковых клеток может различаться в зависимости от клеточной линии и изученного муцина. Было высказано предположение, что избыточная экспрессия MUC6-доменов муцина ингибирует инвазию раковых клеток in vitro
[35], тогда как в некоторых случаях экспрессия этого секретируемого муцина, по-видимому, коррелирует со степенью гистопатологии, которая связана со злокачественным потенциалом [36].
Вполне вероятно, что экспрессия и аномальное гликозилирование нашего мини-муцина в клетках MCF7 приводит к модуляции клеточных и клеточных матричных взаимодействий, что облегчает инвазию клеток MCF7. Было показано, что с использованием двух линий MCF7 и T47D рака молочной железы тандемы повторения MUC6 являются хорошими кандидатами на высокую плотность общего антигена Tn, связанного с раком человека, обнаруженного в этих клеточных линиях [37]. Поэтому мы можем предположить, что избыточная экспрессия тандемных повторов MUC5B в клетках MCF7 может способствовать более высокой экспрессии антигена Tn. Аномальное гликозилирование MUC2 в клетках LSLiM6 обнажает антигены Tn и sialyl Lex на поверхности опухолевых клеток [34], и эти гликановые эпитопы важны при адгезионных взаимодействиях с базальной мембраной и сосудистым эндотелием путем связывания E-селектина, который способствует метастазированию [23 ], [34].
В заключение, сверхэкспрессия MUC5B в раковых клетках MCF7 может стимулировать агрессивное поведение опухолевых клеток за счет увеличения клеточной пролиферации, роста опухоли и распространения. Наше исследование предполагает, что разработка вакцин, направленных против аномально гликозилированных доменов MUC5B, должна оцениваться на предмет рака молочной железы.