Существуют противоречия относительно ассоциации вируса крупного рогатого скота (BLV) и рака молочной железы. Экспериментальные данные на основе ПЦР свидетельствуют о том, что ДНК BLV присутствует в ткани молочной железы и что до 37% случаев рака могут быть связаны с вирусным воздействием. Поскольку эта связь может иметь серьезные последствия для здоровья человека, мы оценили 51 целостный геном образцов рака молочной железы для присутствия ДНК BLV. Среди 32-миллиграммовых последовательностей, полученных из базы данных NCBI генотипа и фенотипа, ни одна из них не была отображена на разных штаммах генома BLV. Контроль за последовательной дивергенцией и провирусными нагрузками дополнительно подтвердил подход. Этот беспристрастный анализ, таким образом, исключает клоновую инъекцию BLV в опухолевых клетках молочной железы и сильно противоречит ассоциации между BLV и раком молочной железы.
BLV, естественно, заражает крупный рогатый скот, водный буйвол, як и зебу 4. Спорадические инфекции с BLV иногда сообщались у других видов, таких как альпака [5]. Экспериментально BLV также может быть передан ряду видов, включая овец [6], коз [6], крыс [7] и кроликов [8]. Инфекция BLV вызывает лимфоцитоз B-клеток, лейкемию и / или лимфому у естественных и некоторых экспериментальных хозяев [1]. Существуют также противоречивые данные, свидетельствующие о том, что BLV может инфицировать людей: (1) антитела против капсида BLV были обнаружены у 74% сывороток человека из сообщества Беркли, Калифорния [9], (2) ДНК BLV была обнаружена в тканях молочной железы с использованием ПЦР 11. Основываясь на положительной корреляции между частотой инфицирования BLV и частотой опухолей (36-59% по сравнению с 29-45% в нормальной ткани), 37% случаев рака молочной железы могут быть связаны с воздействием BLV [12].
Хотя эти наблюдения вызвали некоторый скептицизм в научном сообществе [13], потенциальные последствия для здоровья человека явно требуют дальнейшего изучения.
Чтобы избежать потенциальных экспериментальных артефактов, связанных с методами амплификации ДНК, мы непосредственно проанализировали целые геномы опухолей молочной железы и смежных тканей. После извлечения необработанных ДНК-последовательностей из NCBI dbGaP [14, 15], парные считывания зондировали для выравнивания на разных штаммах BLV с использованием Bowtie2. В качестве положительного контроля фрагмент ядерной ДНК (chr12: 53,959,600-53,964,000), лишенный повторяющихся последовательностей, который привел бы к переоценке выровненных чтений и установил до 4.4 kb, чтобы соответствовать моноблочному 8,8 kb BLV геному, был выбран из генома человека. Выравнивание 51 генома опухолей молочной железы на контрольной последовательности, идентифицированной между 283 и 1287 парными чтениями (показано на рисунке 1 и суммировано в таблице 1). Напротив, никакой гомологии не было найдено с 5 различными подтипами BLV (выделено синим цветом на филогенном дереве на рис.2a). В 19 биопсиях, прилегающих к опухолям молочной железы, 386-1197 парных чтений выровнены по последовательности ядерной ДНК, тогда как ни одна из них не была отображена на BLV (таблица 1). Все образцы ДНК содержали экстраъядерную ДНК, как показано выравниванием контрольной митохондриальной последовательности (NC_012920) (таблица 1). 1Репрезентативное выравнивание последовательности dbGaP считывает ДНК человека и BLV. Пациенты с раком молочной железы были BRC3 из США (исследование phs000472), MEX-BR-15 из Мексики и SX1A2 из Вьетнама (исследование phs000369). Выровненные чтения были визуализированы с использованием интегративного средства просмотра геномики (IGV)
Отсутствие ДНК BLV в 51 целом геноме опухолей молочной железы
Данные секвенирования целых геномов из 51 опухоли молочной железы и 19 нормальных соседних тканей груди были загружены из NCBI dbGaP. Сотни миллионов спаренных считываний на образец были исследованы для выравнивания на разных штаммах BLV и на ядерных и митохондриальных контрольных последовательностях человека
IDC-инфильтрирующая протоковая карцинома, инфильтрация ILC-лобулярной карциномы, MC-карцинома, U неизвестный
Анализ изменения последовательности и провирусной нагрузки в выравниваниях последовательностей. Соседние филогенетические деревья геномов BLV и HTLV-1. b Используя инструмент моделирования ART (NIH), в силико от мутантов были созданы парные чтения с иллюминацией, подобной 100 п.о. 880 симулированных считываний были исследованы для выравнивания по BLV AF033818 с использованием Bowtie2 и визуализированы с использованием IGV. c Корреляция между провирусными нагрузками и прогнозируемым числом чтений
Хотя не может быть идентифицировано парное считывание, соответствующее пяти различным вариантам BLV, остается вероятность того, что обнаружено значительное нарушение вариабельности последовательности. В среднем вся процедура секвенирования генома генерировала 660 миллионов чтений на образец. Учитывая, что длина провируса BLV составляет 8,8 кб и что нормальный человеческий диплоидный геном составляет 6,6 млрд. Пар оснований, среднее число чтений, которое будет генерироваться моноплоидной последовательностью 8,8 кб, составляет 880 (660 000 000/6600 000 000 × 8800) , При условии, что провирус BLV интегрирован в одну копию на ячейку, вся процедура секвенирования генома будет, таким образом, генерировать 880 чтений в среднем. Если деформация в образце расходится с пятью эталонными последовательностями, часть считываний не будет получена. Поэтому варианты BLV искусственно генерировались в силиконе путем введения 2, 3, 6, 10 и 20% нуклеотидных изменений в ссылке AF033818 (мутанты 0,02, 0,03, 0,06, 0,10 и 0,20 соответственно). Филогенетический анализ, показанный на фиг.2а, иллюстрирует, что в силиконовой дивергенции намного превышает максимальные вариации естественной последовательности, наблюдаемые во всем мире [16]. 880 Иллюминационные показания затем были имитированы из них в вариантах силиконов с использованием инструмента моделирования ART и отображены на BLV-геноме AF033818. Большинство читает (818 880), полученное от мутантных 0,02 выровненных по опорной последовательности AF033818 (рис. 2b). Даже сильно расходящийся мутант 0.10 по-прежнему выравнивал 41% своих 880 прочтений по ссылке. До 20% расходимости в мутанте 0.20 требовалось значительно ухудшить обнаружение, хотя специфические чтения BLV все еще были идентифицированы (рис. 2b).
Таким образом, анализ всего генома исключает клоновую интеграцию естественных и сильно расходящихся штаммов BLV в опухолях молочной железы. Поскольку только небольшая часть клеток может нести провирус, чувствительность анализа коррелировала с провирусными нагрузками. Ожидается, что любой естественный вариант BLV, который заразит 10% опухолевых клеток, будет генерировать около 100 прочтений (рис. 2с, пунктирная синяя линия). Количество ожидаемых чтений уменьшается вместе с процентом зараженных клеток, чтобы достичь приблизительно одного прочтения с провирусной нагрузкой 0,1% (фиг.2с, пунктирная синяя линия). Учитывая 59% распространенность опухолей молочной железы, положительную для BLV [12], 30 образцов из наших 51 должны быть положительными. Даже при индивидуальной провирусной нагрузке около 0,1% это должно составлять около 30 просмотров (в среднем по одному на каждого пациента), отображающих BLV, тогда как ни один не был найден.
Используя анализ всего генома, мы пришли к выводу, что нет никаких доказательств для отдельной BLV-специфической или даже связанной с ней последовательности. Расхождения и ограничения этого отчета и другие данные касаются:
Происхождение образцов. Действительно, возможно, что биопсии опухолей из предыдущих исследований, происходящих из США [11, 12] и Колумбии [10], значительно отличаются от тех, которые представлены в базе данных NCBI dbGaP. Даже если мы ограничимся нашими наблюдениями по образцам из США (n = 35), расхождение остается весьма значительным. Действительно, Buehring сообщил о 67 опухолях молочной железы, положительных для BLV в 114 случаях [12], тогда как мы не обнаружили более 35 случаев (значение p для теста на рыбах составляет 1,12 × 10-6).
Метод экстракции ДНК In situ PCR предположил, что провирусная ДНК BLV локализована в цитоплазме [11, 12]. Анализ последовательностей, специфичных для митохондрий (таблица 1) показывает, что база данных NCBI dbGaP включает в себя считывания, соответствующие 16 кб-длинной, циркулярной и экстранядерной митохондриальной ДНК.
Дивергенция деформаций Искусственный силиконовый симулятор сильно расходящихся мутантов все еще идентифицировал специфические чтения BLV (рис. 2b). Поскольку нуклеотидные замены среди штаммов BLV во всем мире ограничены 2,3% [16], остается сомнительно, все ли эти мутанты принадлежат одному и тому же виду. Дальнейший анализ показывает, что геномы опухолей молочной железы не отображаются на последовательностях HTLV-1 (данные не показаны). Почему BLV-консервативные последовательности были ранее идентифицированы с помощью ПЦР, остается загадкой.
Вирусная экспрессия Несмотря на то, что BLV экспрессируется на уровне следов у бычьих пород, вирусный капсидный белок p24 был обнаружен в 5% опухолей молочной железы [12]. Это наблюдение несовместимо с анализом RNASeq, содержащим 154,7 млрд секвенирования транскриптомов, из Исследовательской сети генома рака (17, 18).
Наше настоящее исследование, основанное на анализе всего генома, исключает клоновую вставку BLV в опухолевые клетки и не поддерживает сходящиеся линии доказательств, которые ранее предполагали связь между BLV-инфекцией и раком молочной железы.
NAG и LW разработали эксперимент, проанализировали данные и написали статью. Оба автора прочли и утвердили окончательную рукопись.
Мы благодарим Дэвида Колиньона из CECI (консорциум высокопроизводительных вычислительных центров UCL, ULB, ULg, UMons и UNamur) и Wouter Coppieters с платформы GIGA-Genomics Университета Льежа за их советы по кластерным вычислениям. Мы благодарны NIH dbGaP за предоставление доступа к исследованиям phs000369 и phs000472. Мы благодарим Дэвида Халцена за редактирование рукописи.
Оба автора заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Наборы данных, проанализированные в ходе текущего исследования, доступны от соответствующего автора по разумному запросу.
Последовательности ДНК человека были получены из базы данных NCBI генотипа и фенотипа и обработаны в соответствии с Кодексом поведения NIH для использования геномных данных.
Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.