Матриксные металлопротеиназы и эндометриоз

МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ КАК ОДНО ИЗ ЗВЕНЬЕВ ПАТОГЕНЕЗА НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА

В России эндометриоз встречается у 50% женщин репродуктивного возраста и часто становится причиной бесплодия. Патогенез этого заболевания в настоящее время до конца не изучен, что затрудняет его лечение. По одной из гипотез молекулами, вовлеченными в развитие эндометриоза, являются матриксные металлопротеиназы (ММР). Цель исследования — оценить роль ММР-2 и ММР-9 в патогенезе наружного генитального эндометриоза (НГЭ1). Методом иммуногистохимии в железах эндометрия женщин с НГЭ выявлено увеличение экспрессии ММР-2 на 34—72% и ММР9 — более, чем в 100 раз, по сравнению с нормальным эндометрием. В строме эндометрия у пациенток с НГЭ экспрессия ММР-9 повышалась более, чем в 100 раз. В эндометриальных гетеротопияхженщин с НГЭ экспрессия ММР-2 возрастала на 26—50%, а экспрессия ММР-9 — в 2.5—3.9 раза по сравнению с контролем. При прогрессировании НГЭ экспрессия ММР-2 в железистом компоненте эндометрия повышается. Таким образом, расщепление межклеточного матрикса и базальных мембран эндоте-лиоцитов с участием ММР-2 и ММР-9 лежит в основе имплантации эндометриальных гетеротопий и неоангиогенеза, которые являются ключевыми звеньями НГЭ.

«Издательство Радиотехника»:
научно-техническая литература.
Книги, журналы издательств ИПРЖР, РС-ПРЕСС, САЙНС-ПРЕСС

Тел.: +7 (495) 625-9241

Николай Евгеньевич Кушлинский – член-корр. РАН, д.м.н., профессор, руководитель кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, Московский государственный медико-стоматологический университет им. И.А. Евдокимова Минздрава РФ (Москва)
E-mail: biochimia@yandex.ru
Светлана Владимирована Муштенко – аспирант, кафедра онкологии, Московский государственный медико-стоматологический университет им. И.А. Евдокимова Минздрава РФ (Москва)
Ирина Владимировна Терешкина – к.м.н., соискатель, кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики, Московский государственный медико-стоматологический университет им. И.А. Евдокимова Минздрава РФ (Москва)
Валерия Дмитриевна Ермилова – к.м.н., отдел патологической анатомии опухолей человека, Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава РФ (Москва)
Елена Сергеевна Герштейн – д.б.н., профессор, лаборатория клинической биохимии, Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава РФ (Москва)
Наталья Евгеньевна Левченко – д.м.н., профессор, руководитель отделения онкогинекологии, Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава РФ (Москва)

Представлен обзор литературы по фундаментальным и клиническим исследованиям семейства матриксных металлопротеиназ (ММП) и их тканевых ингибиторов (ТИМП) в эндометрии. Подробно охарактеризованы моле-кулярно-биологические особенности ММП и ТИМП в норме, при эндометриозе и раке эндометрия, а также ре-зультаты таргетной терапии заболеваний эндометрия.

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Татьяна Сергеевна Клейменова, Анна Олеговна Дробинцева, Виктория Олеговна Полякова, Анна Алексеевна Цыпурдеева

Актуальность. Кисспептин (КISS1) кодируется геном KISS1 и вместе с рецептором ( KISS1R ) подавляет метастазирование злокачественных опухолей и регулирует выработку гонадотропин-рилизинг-гормона, который в свою очередь способствует секреции эстрадиола и прогестерона. Активация синтеза стероидных гормонов системой KISS1/ KISS1R в теории может влиять на гормонально зависимые заболевания, такие как эндометриоз. Показано, что экспрессия KISS1 подавляет активность ряда матриксных металлопротеиназ (ММП). Цель — выделить клеточные культуры эндометрия от пациенток с эндометриозом и без него; провести иммуноцитохимический анализ экспрессии белков KISS1, KISS1R и ММП-2, -9; культуральные тесты: Scratch-тест и анализ миграционной активности. Результаты исследования. Иммуноцитохимический анализ показал, что KISS, KISS1R и ММП-2, -9 присутствуют в клеточной культуре. В ходе культуральных тестов было установлено, что при эндометриозе повышается миграционная способность клеточной культуры.

EXPRESSION OF KISSPEPTIN AND MATRIX METALLOPROTEINASES IN HUMAN ENDOMETRIAL CULTURE: A STUDY OF INVASIVE AND MIGRATORY PROPERTIES

Hypothesis/aims of study. Kisspeptin (KISS1) is encoded by KISS1 gene and its interaction with KISS1 receptor ( KISS1R ) suppresses metastasis and regulates release of gonadotropin-releasing hormone, which promotes secretion of estradiol and progesterone. Steroid hormone synthesis is regulated by KISS1/ KISS1R and its activation can be involved in hormone dependent disorders such as endometriosis. KISS1 expression has been shown to inhibit the activity of a number of matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we aimed to isolate endometrial cell cultures from patients with and without endometriosis; to evaluate KISS1, KISS1R , MMP-2, and MMP-9 protein expression by immunocytochemistry; and to perform culture tests: the scratch assay and the analysis of cell migration activity. Results. It was found that the endometrial cell cultures expressed KISS1, KISS1R , MMP-2, and MMP-9 proteins, with the cell migration ability enhanced.

ЭКСПРЕССИЯ КИССПЕПТИНА И МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В КУЛЬТУРЕ ЭНДОМЕТРИЯ ЧЕЛОВЕКА: ИССЛЕДОВАНИЕ ИНВАЗИВНЫХ И МИГРАЦИОННЫХ СВОЙСТВ

Поступила: 17.01.2019 Одобрена: 19.02.2019 Принята: 18.03.2019

■ Актуальность. Кисспептин (KISS1) кодируется геном KISS1 и вместе с рецептором (KISS1R) подавляет ме-тастазирование злокачественных опухолей и регулирует выработку гонадотропин-рилизинг-гормона, который в свою очередь способствует секреции эстрадиола и прогестерона. Активация синтеза стероидных гормонов системой KISS1/KISS1R в теории может влиять на гормонально зависимые заболевания, такие как эндометриоз. Показано, что экспрессия KISS1 подавляет активность ряда матриксных металлопротеиназ (ММП).

Цель — выделить клеточные культуры эндометрия от пациенток с эндометриозом и без него; провести имму-ноцитохимический анализ экспрессии белков KISS1, KISS1R и ММП-2, -9; культуральные тесты: Scratch-тест и анализ миграционной активности.

Результаты исследования. Иммуноцитохимический анализ показал, что KISS, KISS1R и ММП-2, -9 присутствуют в клеточной культуре. В ходе культуральных тестов было установлено, что при эндометриозе повышается миграционная способность клеточной культуры.

■ Ключевые слова: эндометриальная культура клеток; кисспептин; рецептор кисспептина; матриксные метал-лопротеиназы; наружный генитальный эндометриоз; миграция клеток.

EXPRESSION OF KISSPEPTIN AND MATRIX METALLOPROTEINASES IN HUMAN ENDOMETRIAL CULTURE: A STUDY OF INVASIVE AND MIGRATORY PROPERTIES

1 The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott, Saint Petersburg, Russia;

2 Saint Petersburg State Pediatric Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Saint Petersburg, Russia;

3 Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia

Received: January 17, 2019 Revised: February 19, 2019 Accepted: March 18, 2019

■ Hypothesis/aims of study. Kisspeptin (KISS1) is encoded by KISS1 gene and its interaction with KISS1 receptor (KISS1R) suppresses metastasis and regulates release of gonadotropin-releasing hormone, which promotes secretion of estradiol and progesterone. Steroid hormone synthesis is regulated by KISS1/KISS1R and its activation can be involved in hormone dependent disorders such as endometriosis. KISS1 expression has been shown to inhibit the activity of a number of matrix metalloproteinases (MMPs). In this study, we aimed to isolate endometrial cell cultures from patients with and without endometriosis; to evaluate KISS1, KISS1R, MMP-2, and MMP-9 protein expression by immunocytochemistry; and to perform culture tests: the scratch assay and the analysis of cell migration activity.

Журнал акушерства и женских болезней 201Q Том го Выпуск 2 ISSN 1684-0461 (Print)

Journal of Obstetrics and Women’s Diseases 2019 Volume 68 Issue 2 ISSN 1683-9366 (Online)

Results. It was found that the endometrial cell cultures expressed KISS1, KISS1R, MMP-2, and MMP-9 proteins, with the cell migration ability enhanced.

■ Keywords: human endometrial culture; kisspeptin; KISS1R; matrix metalloproteinases; external genital endometriosis; cell migration.

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) характеризуется ростом ткани, сходной с эндометрием, за пределами полости матки, что обусловлено протеолитическими свойствами стромы внутренней оболочки матки. В этом механизме задействованы различные протеазы, в том числе металлопротеиназы 2-го и 9-го типов [1, 2]. Очаги эндометриоза могут быть локализованы в слизистой оболочке, мышечной ткани, серозе, клетчатке, коже и даже в костной ткани [3]. Эндометриоз обладает способностью метастазировать — по одной из теорий распространение клеток осуществляется током крови или лимфы. Различные молекулы были интенсивно исследованы как потенциальные терапевтические цели, среди них аромата-за Р450 [4], эстрогены [5], цитокины [6], фактор некроза опухоли [7] и др. Однако ни одна из предложенных сейчас терапий не гарантирует выздоровления и отсутствие рецидивов заболевания.

Кисспептин — пептидный гормон, подавляющий миграционную активность клеток трофобласта [8] и, возможно, регулирующий образование гетеротопий при эндометриозе. К^1 был первоначально описан как белок, супрессирующий метастазирование опухолевых клеток при меланоме кожи [9]. У человека он был обнаружен как лиганд рецептора, связанного с G-белком 54 ^РК54), в настоящее время называемого К^Ш [10]. Ген К18Б1 кодирует несколько белков, которые составляют семейство кисспептинов. Кисспептин представляет собой пептид, содержащий 145 аминокислотных остатка [11]. От С-конца может отщепляться 54-аминокислотный пептид — кисспептин 54 (КISS-54), который в основном вырабатывается в плаценте. Существуют также К^-14, К^-13, К^-10. Они тоже обладают биологической активностью, хотя пока неясно, в какой степени эти пептиды генерируются эндогенно [12].

Ранее нами было выполнено исследование экспрессии кисспептина и его рецептора в ткани эндометрия и эндометриальных гете-ротопий [13]. При иммуногистохимическом исследовании эндометрия и гетеротопий было

выявлено, что экспрессирует-

ся как в основной, так и в контрольной группе. Уровень экспрессии К^1/К^Ш в ткани эндометрия, взятого у пациентки с диагнозом НГЭ, был статистически значимо снижен по сравнению с контролем. Эти данные подтверждает другое исследование, в котором изучали НГЭ I и II степеней: при гормональном обследовании было обнаружено, что уровень кисспептина в периферической крови пациенток с НГЭ достоверно выше по сравнению с уровнем в контрольной группе. Было также показано, что в очагах эндометриоидных гете-ротопий, которые располагались на брюшине малого таза, отмечалось достоверное повышение экспрессии белка К^1 и рецептора К^Ш по сравнению с фрагментами интактной брюшины [14].

Многие исследователи сообщают, что в развитии эндометриоидных гетеротопий большую роль играют матриксные металлопротеина-зы (ММП). Семейство ММП — это группа родственных по структуре цинксодержащих эндо-пептидаз, разрушающих базальные мембраны и внеклеточный матрикс при физиологических и патологических условиях [15]. К^1 подавляет активность ряда ММП, что может рассматриваться в качестве механизма, посредством которого К^1 подавляет метастазирование, а возможно, и прикрепление и проникновение фрагментов эндометриоидной ткани в различные органы при эндометриозе. В ряде исследований было продемонстрировано подавление 2-го или 9-го типа ММП белком кисспептином [1, 16]. Важно отметить, что активные ММП могут расщеплять пептидную связь между Gly118 и Ьеи119 в белковой последовательности К^-54. В результате этого удаляются три аминокислоты с Оконца пептида, что приводит к инактивации КISS-54. Этот механизм может регулировать обратную связь между кисспеп-тином и ММП.

Эндометрий — это сложная, многокомпонентная система, состоящая из покровного и железистого эпителия, стромы, основного вещества и кровеносных сосудов. Первые клеточные культуры эндометрия были выделены в 70-х гг. прошлого века [17], но до сих пор эта

модель для изучения взаимодействия клеток и оценки действия лекарственных препаратов остается актуальной. Культуру эндометрия использовали также для изучения инвазии бла-стоцисты в стромальный слой эндометрия [18], исследования ориентации эмбриона в полости матки [19] и для получения мезенхимальных стволовых клеток [20].

Цель данного исследования заключалась в выделении клеточной культуры эндометрия от пациенток с НГЭ, характеристике миграционных свойств полученной культуры и оценке экспрессии К^1/К^Ш с целью дальнейшего использования в качестве возможной модели для изучения лекарственных препаратов.

Исследование проводили на материале, взятом у 7 пациенток. Весь материал был разделен на две группы: контрольную (п = 4) и группу с НГЭ. В группу с НГЭ входил материал от пациенток с НГЭ I (п = 1) и IV (п = 2) стадий. В контрольной группе биопсию эндометрия выполняли с диагностической целью путем проведения гистеро- или лапароскопии и пай-пель-биопсии. Способ и результат выделения клеточной культуры не зависели от метода получения материала. Возраст пациенток составил от 23 до 38 лет. Все доноры проходили обследование в отделении оперативной гинекологии. В контрольной группе пациентки имели регулярный менструальный цикл. При обследовании у пациенток инфекций репродуктивного тракта выявлено не было. Материал для выделения клеточной культуры забирали на 21-22-й день менструального цикла в пяти случаях и на 7-12-й день — в двух случаях.

Методика выделения эндометриальной клеточной культуры отработана и подробно описана в статье Э.К. Айламазяна и др. [21]. В данной работе в качестве фермента использовали коллагеназу II типа ^Шсо), клетки культивировали в среде DMEM/F-12 с 10 % FBS, оптимальная концентрация при высаживании на флакон равнялась 1 • 103 клеток в миллилитре. Описанная методика позволяет получить культуру эндометриальных клеток стро-мального и железистого происхождения для широкого спектра исследований. Для образования монослоя культуре клеток требовалось 1-2 дня. Иммуноцитохимический анализ проводили с помощью покровных стекол

Menzel (d = 6 мм) на первом пассаже. В качестве первичных антител использовали: anti-kisspeptin monoclonal antibody (1 : 100, Abcam), anti-KISS1R polyclonal antibody (1 : 200, Abcam), anti-MMP-9 monoclonal antibody (1 : 100, abcam) и anti-cytokeratin-8 (1 : 100, Dako). В качестве вторичных антител применяли антитела, конъ-югированные с флуорохромом Alexa Fluor 647 и AlexaFluor 488 (1 : 1000, Abcam). В качестве контроля специфичности антител производили иммуноцитохимическую реакцию без использования первичных антител.

Культуры криоконсервировали в 10 % DMSO на сыворотке, разливали суспензию клеток в криовиалы с концентрацией не менее 1 • 106. Криовиалы переносили в контейнер для замораживания при -80 °С (Mr. Frosty, Nalgene). Через сутки клетки переносили в сосуды Дюара с жидким азотом для длительного хранения. Процедуру оттаивания проводили в водяной бане при 37 °С. Жизнеспособность размороженной культуры определяли с помощью красителя трипанового синего.

Для оценки инвазии клеток применяли вставки Falcon в 24-луночные планшеты (BD Biosciences, США) диаметром пор 8 мкм. Суспензию эндометриальных клеток в среде DMEM/F-12 вносили в верхнюю камеру (вставку), а в нижнюю камеру (лунку) вносили фетальную телячью сыворотку, а во второй серии экспериментов в нижнюю камеру вводили аутологичную перитонеальную жидкость. Планшеты инкубировали 10 ч при 37 °С в атмосфере с 5 % CO2 и затем подсчитывали количество клеток, проникших через поры вставки в нижнюю камеру.

Анализ в подгруппах

Результаты иммуноцитохимического исследования архивировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FlueView1000 с программным обеспечением ASW. Оценку осуществляли в программе Морфология 5.0, при этом исследовали такие

параметры, как относительная площадь экспрессии и средняя яркость.

Для статистической оценки различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли ранговый (7-крите-рий Манна — Уитни в программе $1аи81:1са 7.0. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что К^1/К^Ш в большей степени экспрессируется цилиндрическими клетками эпителия железы, а не соединительнотканными клетками стромы [13], в связи с чем клеточная культура была проанализирована на наличие эпителиоподобных железистых клеток с использованием маркера цитокератина-8. По данным S. ШопоШгекэо, ци-токератин-8 — это цитоплазматический белок, являющийся специфическим маркером клеток однослойного плоского эпителия. Число железистых клеток варьировало от образца к образцу (5Эксск-8 = 5,72-38,29 %) [22].

Было установлено, что кисспептин, его рецептор и ММП-2, -9 присутствуют в первичной клеточной культуре эндометрия в единичных клетках (табл. 1).

При оценке относительной площади экспрессии кисспептина была выявлена тенденция к уменьшению уровня белка при НГЭ. При этом при НГЭ IV степени были установлены самые низкие показатели (5эксК1881 = 0,568). Эти различия не являются статистически до-

стоверными. Для более тщательного анализа требуется увеличить количество исследуемых клеточных культур. При оценке рецептора к кисспептину не было обнаружено никаких закономерных различий в уровне экспрессии.

Миграция и инвазия — ключевые свойства живых клеток, играющие решающую роль в нормальном развитии организма, иммунного ответа и патологических процессов, таких как метастазирование при раке и воспалительные процессы 23. Изучение миграции клеток в исследованиях эндометриоза представляет особый интерес, поскольку одной из основных проблем НГЭ является образование эндомет-риоидных гетеротопий. В нашем исследовании был проведен анализ инвазии клеточных культур, основанный на измерении подвижности клеток и активности движения клеток по градиенту химиоаттрактанта. Было показано, что в контрольной группе количество клеток, прошедших через трансаэробный фильтр (пора 8 мкм) и прикрепившихся на поверхности, варьировало от 4,6 до 16,3 в пяти полях зрения (при увеличении х40). В клеточной культуре, полученной при эндометриозе, эти цифры практически не отличались и равнялись 6,5-12,8 (рис. 1). Добавление перитонеальной жидкости в нижнюю камеру не влияло на миграционные способности клеток контрольной группы, однако усиливало инвазию в группе с НГЭ. Полученные данные объясняются повышением в перитонеальной жидкости пациенток с НГЭ числа цитокинов, активирующих ангиогенез (ИЛ-1^, ИЛ-6 и ИЛ-8) и стимулирующих адгезию клеток эндометрия к мезоте-лию брюшины (ФНОа) [26], а также факторов

Таблица 1 / Table 1

Показатели экспрессии исследуемых белков в клеточной культуре эндометрия Protein expression indicators in the endometrial cell cultures

Возраст День менструального цикла Контроль/ степень наружного генитального эндометриоза Относительная площадь экспрессии KISS1, % Относительная площадь экспрессии KISS1R, % Относительная площадь экспрессии ММП-2, % Относительная площадь экспрессии ММП-9, %

Цель исследования – определить, связаны ли лейомиома, аденомиоз и полипы эндометрия с изменениями матриксных металлопротеиназ (семейство внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса) полости матки (ММП-2 и ММП-9) и цитокинов.

Матричные металлопротеиназы и цитокины полости матки при лейомиоме, аденомиозе, полипе эндометрия. Методы исследования

Ирригация полости матки проводилась у женщин с лейомиомой, аденомиозом и полипами эндометрия, а также у женщин с нормальной маткой.

ММП-2 и ММП-9 определяли при промывании матки методом желатиновой зимографии (электрофоретическая технология, основанная на SDS-PAGE, которая включает субстратную сополимеризацию с полиакриламидным гелем, для обнаружения ферментативной активности). Для отдельных испытуемых общий уровень ММП был получен путем добавления полуколичественных оценок плотностей полос, связанных с желатиназами в зимограммах. Интерлейкин-1beta (IL-1beta), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), интерферон-гамма (IFN-гамма) и трансформирующий фактор роста-бета1 (TGF-бета1) измеряли с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ИФА).

Полость матки пациенток с лейомиомой, аденомиозом и полипами эндометрия имела достоверно более высокие показатели ММП по сравнению с контрольной группой.
Несмотря на то, что средние уровни интерлейкина-1beta были повышены в матке с патологией по сравнению с нормальной маткой, цитокин был достоверно повышен только в аденомиотической группе.
Достоверно повышенные уровни интерферон-гамма обнаружены в матке при лейомиоме и полипах эндометрия.
Ирригация матки с лейомиомой и аденомиозом содержало достоверно повышенные средние уровни трансформирующего фактора роста-бета1 по сравнению с контролем, в то время, как фактор некроза опухоли-альфа был достоверно выше только при лейомиоме.
При сравнении уровней маточных цитокинов по отношению к отдельным уровням ММП была обнаружена достоверная связь между трансформирующим фактором роста-бета1 и повышенными уровнями ММП-9 и общей ММП при лейомиоме.
Также была обнаружена значимая связь между интерлейкином-1beta и повышенными уровнями ММП-2, ММП-9 и общего ММП в группе полипа эндометрия.

Полость матки при лейомиоме, аденомиозе и полипах эндометрия содержит повышенные уровни ММП и цитокинов по сравнению с нормальной маткой. При некоторых патологиях повышенные цитокины ассоциированы с повышенным уровнем ММП.